【摘要】：人類呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)是世界范圍內(nèi)引起各年齡組下呼吸道感染的重要病毒病原體之一,尤見于嬰幼兒、老年人和免疫抑制個體,但臨床上至今尚無安全有效的疫苗。本課題的研究目的是篩選出一種或幾種HRSV的理想純化方法,并對不同純化產(chǎn)物進行免疫原性評價,為HRSV裂解純化疫苗的研制積累一定的基礎(chǔ)資料。研究內(nèi)容主要包括：HRSV在人二倍體KMB17細胞上的大量繁殖、病毒收獲液的超濾濃縮、HRSV不同方法的純化和純化條件的探索,以及純化產(chǎn)物的免疫原性評價,并對滅活劑、佐劑和免疫程序等免疫原性的影響因素進行探索。 使用細胞工廠和羅氏瓶兩種容器培養(yǎng)HRSV,兩者均可獲得較高感染性滴度的病毒。細胞工廠培養(yǎng)HRSV的最佳條件還需進一步探索。 將病毒收獲液以100kD濾膜包超濾濃縮30倍和103倍后,分別使用蔗糖密度梯度離心法和Sepharose 4FF凝膠過濾層析法進行純化,并對純化產(chǎn)物進行感染性滴度檢測、SDS-PAGE還原電泳分析及Western blot鑒別。經(jīng)還原電泳,2種純化方法制備的純化產(chǎn)物都在60～70kD間呈現(xiàn)一主要條帶,Western blot證實為HRSV特異性F蛋白。結(jié)果表明Sepharose 4FF凝膠過濾層析法比蔗糖密度梯度離心法更適合于HRSV的純化,效果更好、效率更高。但柱體積、上樣量、洗脫流速等條件會對純化效果產(chǎn)生影響。 將蔗糖密度梯度離心和Sepharose 4FF凝膠過濾層析2種方法純化HRSV所得樣品免疫ICR小鼠,抗體陽轉(zhuǎn)率相同,中和抗體幾何平均效價(GMT)相近,雖然免疫劑量不同(前者的病毒蛋白含量是后者的2.5倍),但二者的免疫原性無統(tǒng)計學(xué)差異,說明Sepharose 4FF凝膠過濾層析法純化產(chǎn)物的免疫原性較高。 在純化樣品的免疫原性影響因素的探索中,甲醛滅活組的抗體陽轉(zhuǎn)率和中和抗體GMT都比β-丙內(nèi)酯滅活組的高；鋁佐劑對實驗性疫苗的免疫原性影響不大；雖然Od、7d、14d和0d、28d兩個免疫程序均能誘導(dǎo)相對較高的中和抗體水平(1：9.51～1：11.31),但結(jié)果提示多針免疫有助于提高抗體陽轉(zhuǎn)率和中和抗體效價。
【圖文】：

圖2.蔗糖密度梯度離心純化組分的感染性滴度及蛋白含量Fig2.InfeetionstiterandProteineontentofPurifiedfraetionsofHRSVbysuerosdensitygradienteentrifugationSDS一PAGE還原電泳檢測結(jié)果顯示，17個組分中，僅7一n號5個組分都在60一7okD間可見一主要的蛋白帶，，與HRSVF蛋白63kD分子量接近(見圖3)，推測目的病毒可能就集中在這5個樣品中。W亡Stemblot證實上述5個組分的60一7OkD間的條帶具有HRSV特異性(見圖4)。但病毒培養(yǎng)液中的牛皿清白蛋白66k分子量與F蛋白分子量相近，無法通過SDS一PAGE將二者分開。牛血清白蛋白殘留量檢測結(jié)果顯示7號樣的牛血清白蛋白含量為15.5林g/ml、約占總蛋白含量的0.05%)，所以60一70kD間的條帶是HRSVF蛋白和少量牛血清白蛋白的混合物上述5個組分中，以7號和8號組分的目的病毒含量較高，這與圖2所顯示的病毒滴度有一個小峰相吻合。從蛋白含量曲線上可以看出，這5個組分的蛋白含量遠低于2一6號組分，后者主要是一些雜蛋白。因為7號組分與8~11號組分的蛋白條有差異，在50一70kD間有3個條帶故我們將7號組分作為一個單獨樣品，將電泳條帶相似的8、9、10、11號組分合

分;3:9號組分;4:10號組分;5:11號組分;6:30倍濃縮HRSV(30倍稀釋還原)。圖3.蔗糖密度梯度離心純化組分的電泳圖Fig3.EleetroPhoretieProfileofPurifiedfraetionofHRSVbysuerosedensitygradienteentrifugation8號組分;3:分;9號組分;4:10號組5:11號組分;圖4.蔗糖密度梯度離心純化組分的Westernb一ot分析Fig4.WesternblottingofPurinedfraetionsofHRSVbysuerosedensitygradienteentrifugation
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 楊侃;陳智;巫玉峰;;蛋白芯片技術(shù)對1022例急性呼吸道感染的病原學(xué)檢測分析[J];廣西醫(yī)學(xué);2008年05期

2 馬琳;秦國彤;;膜污染的機理和數(shù)學(xué)模型研究進展[J];水處理技術(shù);2007年06期

3 顏淑琴,洪成龍,王敏文,閆玉瑛;小牛血清中乙型腦炎病毒的抗體水平[J];中國生物制品學(xué)雜志;1996年04期

4 俞建昆,謝忠平,董承紅,陳淑范;PEG沉淀HAV的最佳條件[J];中國生物制品學(xué)雜志;1997年01期

5 董關(guān)木,劉增順,鄭海發(fā),曲小素,劉景華,俞永新,李守江,董麗君,李雅麗,劉玉華,杜鵑,何世偉,查麗,周得水;精制地鼠腎細胞狂犬病疫苗的效果觀察[J];中國生物制品學(xué)雜志;1999年03期

6 龍潤?quán)l(xiāng),謝忠平,洪超,徐瓊芬,李華,段維國,張雪梅;牛血清質(zhì)量及其中甲肝抗體對甲肝疫苗生產(chǎn)的影響[J];中國生物制品學(xué)雜志;2004年04期

7 王輝;過琴媛;張月蘭;張穎;白江;趙蘭英;鐘書聲;張晉;田博;羅書榮;;不同方法制備Vero細胞乙型腦炎純化疫苗的質(zhì)量比較[J];中國生物制品學(xué)雜志;2006年02期

8 杜麗娟;王世光;張立;陳爾佳;楊U

本文編號：2684447