本文關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：單核細(xì)胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes,LM)作為四大重要食源性病原菌之一,對(duì)人類及多種畜禽健康威脅極大,可以突破宿主的腸道屏障,血腦屏障和血胎屏障,臨床上引起腸胃炎、腦膜腦炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀,尤其是對(duì)幼齡和妊娠母畜,發(fā)病急,死亡率高。LM細(xì)胞胞壁表面分布多種毒力蛋白,在感染機(jī)體過程中發(fā)揮重要作用,其中有一類至關(guān)重要的表面蛋白的前體蛋白C端含有保守基序LPXTG,Srt A是一種分選酶能夠識(shí)別表面蛋白C末端的保守基序LPXTG,共價(jià)結(jié)合到肽聚糖上,呈現(xiàn)在細(xì)胞表面發(fā)揮毒力作用,是毒力蛋白可以錨定到細(xì)菌細(xì)胞壁過程中的關(guān)鍵。本研究以李斯特菌病綿羊腦組織臨床分離的單核細(xì)胞增多性李斯特菌(簡稱LM90SB2,4b血清型)為研究對(duì)象,首先對(duì)LM90SB2的srt A基因進(jìn)行序列分析及原核表達(dá);構(gòu)建LM90SB2的srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A),對(duì)比分析生化特性,生長特性,對(duì)小鼠和不同種屬類型細(xì)胞的毒力等生物學(xué)功能,為探究LM的Srt A分選的蛋白譜,尋找新的毒力蛋白研究奠定了重要基礎(chǔ);在LM致病機(jī)理研究中和藥物靶標(biāo)的篩選上同樣具有重要作用。1.LM90SB2 srt A基因的序列分析與原核表達(dá):為了探究LM90SB2的srt A基因的特異性及其在原核表達(dá)質(zhì)粒p ET32a中的表達(dá)。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增LM90SB2的srt A基因,測序后用DANMAN軟件與已公布的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行序列比對(duì)分析,將srt A克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒p ET32a中構(gòu)成重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a-srt A。質(zhì)粒p ET32a-srt A轉(zhuǎn)化到蛋白表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)中,異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)使其表達(dá),SDS-PAGE電泳檢測,同時(shí)采用Western-blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:LM90SB2與標(biāo)準(zhǔn)株LMF2365(serovar 4b,NC_002973)srt A基因的核苷酸同源性為100%;Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western-blotting檢測分析其為一個(gè)分子量為47k D的融合蛋白與預(yù)期的大小相符合。2.LM90SB2 srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A)的構(gòu)建與鑒定:基因缺失是研究基因功能常用的方法,本實(shí)驗(yàn)利用同源重組的方法構(gòu)建LM90SB2 srt A基因缺失株(LM90SB2-△srt A),為研究LM的srt A基因的功能奠定基礎(chǔ)。用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)融合引物,PCR擴(kuò)增LM90SB2 srt A基因的上下游同源臂,運(yùn)用融合PCR(SOE-PCR)的方法連接上下臂獲得缺失srt A基因的同源片段(△srt A),連接到p MD19-T構(gòu)成p MD19-T-△srt A,基因測序結(jié)果正確后將△srt A克隆到質(zhì)粒p KSV7中構(gòu)成重組質(zhì)粒p KSV7-△srt A。將質(zhì)粒p KSV7-△srt A電轉(zhuǎn)化入LM90SB2中,篩選陽性克隆,在高溫和10μg/ml氯霉素抗性條件下連續(xù)傳代,發(fā)生同源重組,用兩對(duì)引物(srt AF1和srt AR2,srt AF和srt AR)PCR驗(yàn)證缺失片段。再置于無抗性的30℃條件下連續(xù)傳代獲得穩(wěn)定的srt A基因缺失株LM90SB2-△srt A。在無氯霉素抗性的BHI液體培養(yǎng)基中,37℃,180 rpm條件下連續(xù)傳代培養(yǎng)20代,PCR檢測無毒力返祖現(xiàn)象,表明該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。3.對(duì)比分析LM90SB2-△srt A部分生物學(xué)特性:對(duì)比分析缺失株LM90SB2-△srt A與野生株LM90SB2的部分生物學(xué)特性的差異,來探究srt A基因?qū)τ贚M90SB2毒力的影響。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)比分析了細(xì)菌的生化特性、溶血效價(jià)、耐酸耐堿性、生物膜形成能力;對(duì)于MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC的粘附,侵襲和胞內(nèi)增殖能力以及對(duì)BALB/c小鼠的致病能力影響。結(jié)果表明:srt A基因的缺失后,LM90SB2的生化特性、耐酸耐堿性無變化;溶血效價(jià)、生物膜形成能力稍有差異;LM90SB2對(duì)不同細(xì)胞的粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖能力不同,對(duì)RAW264.7的感染效率最高,對(duì)腦細(xì)胞的感染效率相對(duì)較低;srt A基因缺失后顯著降低了LM90SB2對(duì)HBMEC,RAW264.7,SIEC細(xì)胞的粘附率和對(duì)MBMEC,RAW264.7,SIEC細(xì)胞的侵襲率(P0.05),對(duì)LM90SB2在MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC中的增殖趨勢未有明顯影響,但細(xì)菌含量有所降低;srt A基因缺失后LM90SB2對(duì)BALB/c雌性小鼠的LD50值升高了1.63個(gè)對(duì)數(shù)級(jí),在感染了4天后小鼠的肝臟、脾臟和腦中的含菌量有所降低。表明srt A基因缺失后LM90SB2對(duì)細(xì)菌和細(xì)胞的侵染能力有所下降。
【關(guān)鍵詞】：單核細(xì)胞增多性李斯特菌 原核表達(dá) 同源重組 基因缺失 生物學(xué)特性
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61;R378
【目錄】：

• 全文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞表12-13
• 引言13-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-27
• 1. LM的一般特性14-18
• 1.1 LM的生物學(xué)特征14-15
• 1.2 LM的流行病學(xué)特征15-16
• 1.3 李斯特菌病的臨床癥狀16
• 1.4 李斯特菌病的診斷與防治16-18
• 2. LM的毒力因子及致病機(jī)制18-24
• 2.1 LM侵入細(xì)胞相關(guān)的主要毒力因子19-22
• 2.2 LM的毒力調(diào)控因子22-24
• 3.分選酶的研究進(jìn)展24-27
• 3.1 分選酶的結(jié)構(gòu)與功能24-25
• 3.2 LM的分選酶蛋白25
• 3.3 分選酶的應(yīng)用前景25-27
• 第二章 試驗(yàn)部分27-59
• 實(shí)驗(yàn)一 LM90SB2 srtA基因序列分析及原核表達(dá)27-35
• 摘要27-28
• 1.材料28
• 1.1 菌株、質(zhì)粒及引物28
• 1.2 主要試劑和儀器28
• 2.方法28-31
• 2.1 LM90SB2基因組DNA的制備及srtA基因的擴(kuò)增28-29
• 2.2 E.coli DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞的制備（CaCl2）29
• 2.3 srtA基因與pMD19-T的連接29-30
• 2.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-srtA的構(gòu)建30
• 2.5 srtA基因在E.coli BL21（DE3）中的表達(dá)30
• 2.6 Western-blotting鑒定重組蛋白30-31
• 3.結(jié)果31-34
• 3.1 LM90SB2 srtA基因的克隆及序列分析31
• 3.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-srtA的鑒定31-32
• 3.3 srtA基因在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析結(jié)果32-33
• 3.4 表達(dá)產(chǎn)物Western-blotting分析結(jié)果33-34
• 4.討論34-35
• 實(shí)驗(yàn)二 LM90SB2-△srtA缺失株的構(gòu)建35-47
• 摘要35
• 1.材料35-37
• 1.1 菌株、質(zhì)粒及引物35-36
• 1.2 主要試劑與儀器36-37
• 2.方法37-40
• 2.1 srtA基因上下游同源臂的擴(kuò)增及SOE-PCR37-38
• 2.2 融合同源臂△srtA與pMD19-T的連接38
• 2.3 重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-△srtA的構(gòu)建38
• 2.4 電轉(zhuǎn)用LM 90SB2感受態(tài)細(xì)胞的制備38-39
• 2.5 pKSV7-△srtA質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到LM90SB2感受態(tài)細(xì)胞中39
• 2.6 同源重組39-40
• 2.7 LM90SB2-△srtA基因缺失株的遺傳穩(wěn)定性鑒定及生長特性40
• 3.結(jié)果40-46
• 3.1 srtA基因上下游同源臂的擴(kuò)增和SOE-PCR結(jié)果40-41
• 3.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-△srtA和pKSV7-△srtA酶切鑒定結(jié)果41-42
• 3.3 電轉(zhuǎn)后陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定42-43
• 3.4 同源重組結(jié)果的篩選與鑒定43-45
• 3.5 LM90SB2-△srtA缺失株鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析和生長曲線測定結(jié)果45-46
• 4.討論46-47
• 實(shí)驗(yàn)三 LM90SB2-△srtA缺失株部分生物學(xué)特性研究47-59
• 摘要47
• 1.材料47-48
• 1.1 菌株、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物47-48
• 1.2 主要試劑和儀器48
• 2.方法48-51
• 2.1 生化特性鑒定48-49
• 2.2 溶血效價(jià)的測定49
• 2.3 耐酸耐堿生長曲線測定49
• 2.4 生物膜形成能力的測定49-50
• 2.5 對(duì)MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附、侵襲和胞內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)50
• 2.6 LD50的測定50-51
• 2.7 感染小鼠后肝、脾、腦載菌量的測定51
• 3.結(jié)果51-57
• 3.1 生化鑒定結(jié)果51
• 3.2 溶血效價(jià)的測定結(jié)果51-52
• 3.3 耐酸耐堿生長曲線52
• 3.4 生物膜形成能力的測定結(jié)果52-53
• 3.5 對(duì)MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附率、侵襲率和胞內(nèi)增殖能力53-55
• 3.6 LD50的測定結(jié)果55
• 3.7 感染小鼠后肝、脾、腦載菌量的測定結(jié)果55-57
• 4.討論57-59
• 全文結(jié)論59
• 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-68
• 附錄68-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71-72
• 附件72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 崔煥忠;喬立橋;王義沖;;單核細(xì)胞增生性李斯特菌的主要毒力因子及其致病機(jī)理[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年01期

2 羅正;劉若塵;鄭世軍;;單核增生性李氏桿菌溶血素的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備[J];生物工程學(xué)報(bào);2009年11期

3 鄧興梅;魏麗;馬勛;蔣建軍;于佳佳;吳學(xué)林;;單核細(xì)胞增多性李斯特菌對(duì)人、鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、侵襲、增殖差異性分析[J];石河子大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年03期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 蔣建軍;缺失inlC2突變株增強(qiáng)單核細(xì)胞增多癥李斯特菌對(duì)上皮細(xì)胞的內(nèi)化作用的研究[D];石河子大學(xué);2011年

2 譚炳乾;單核細(xì)胞增多性李斯特菌PCR和PCR-ELISA檢測方法的建立[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王莉;Sigma B在單核細(xì)胞增生李斯特菌耐受抗生素中的作用[D];華中師范大學(xué);2012年

  本文關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞增生性李斯特菌srtA基因缺失株的構(gòu)建及其部分生物學(xué)特性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：264885