【摘要】：組織穩(wěn)態(tài)需要死細(xì)胞的去除和新細(xì)胞的產(chǎn)生之間保持良好平衡。因?yàn)閿z入的食物、病原體和毒素會損傷上皮,胃腸道依賴于不斷的自我更新來維持穩(wěn)態(tài)。成體腸道干細(xì)胞(intestinal stem cells,ISCs)可以產(chǎn)生腸道上皮的所有成熟細(xì)胞類型,在該過程中任何不平衡都可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。在成年哺乳動物小腸中,ISC細(xì)胞群靠近腸腺隱窩底部,每個隱窩每天約產(chǎn)生300個細(xì)胞。這個過程由每個隱窩的4_(~~)6個ISCs支持,ISCs遷移到隱窩中,經(jīng)歷轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增分裂,分化為腸絨毛的主要成分--腸吸收細(xì)胞。許多經(jīng)典的信號通路包括Notch、BMP和Wnt,已被證明在增殖過程中起關(guān)鍵作用。然而,由于缺乏特定的干細(xì)胞標(biāo)記,直到現(xiàn)在也難以精確鑒定和研究這個細(xì)胞群。果蠅與哺乳動物的腸道在發(fā)育、細(xì)胞組成和遺傳控制方面具有很大的相似性,在腸道病理生理學(xué)和再生以及控制它們的信號傳導(dǎo)途徑之間具有相當(dāng)?shù)谋Ｊ匦�。成年果蠅腸道干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為研究腸道干細(xì)胞生物學(xué)提供了一個新的模型系統(tǒng)。果蠅ISC細(xì)胞核小,可特異性表達(dá)Notch的配體Delta。ISC進(jìn)行自我更新產(chǎn)生一個新的ISC和一個未分化成熟的中間過渡細(xì)胞(enteroblasts,EBs),ISCs和EB細(xì)胞都可以表達(dá)Snail/Slug家族的轉(zhuǎn)錄因子escargot(esg)。EB細(xì)胞可分化為具有吸收營養(yǎng)物質(zhì)功能的腸上皮細(xì)胞(enterocytes,ECs)和腸內(nèi)分泌細(xì)胞(enteroendocrine cells,EEs),ECs有大的細(xì)胞核,被Pdm1(Nubbin)標(biāo)記,EE細(xì)胞可被Prospero標(biāo)記。研究果蠅腸道干細(xì)胞的自我更新和分化調(diào)控機(jī)制可以為人類或其它脊椎動物的腸道干細(xì)胞的增殖與分化研究提供更多線索。根據(jù)現(xiàn)階段的研究進(jìn)展,我們知道穩(wěn)態(tài)及再生條件下Wnt、Notch、EGFR、JAK-STAT信號通路對腸道干細(xì)胞的增殖及分化起著重要的調(diào)控作用。通過RNAi果蠅系高通量篩選,研究人員已篩選到405個蛋白編碼基因參與調(diào)控果蠅腸道干細(xì)胞的增殖與分化。近年來長非編碼RNA受到普遍關(guān)注,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了上千個lncRNAs,其在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后方面發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。非編碼RNA是否參與腸道干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控過程尚不清楚。利用來自清華大學(xué)高冠軍教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的82株lnc RNAs敲除果蠅株,與esg-Gal4果蠅通過遺傳雜交整合在同一株果蠅中。esg可驅(qū)動GFP或DsRed在ISC/EB細(xì)胞中表達(dá),在lncRNA突變的背景下,觀察GFP或DsRed標(biāo)記的ISC/EB細(xì)胞數(shù)目及大小的改變。我們共得到70株整合果蠅株,其中X染色體5株,Ⅱ染色體36株,Ⅲ染色體29株。其中15個lncRNAs在腸道中表達(dá),包括X染色體2個,Ⅱ染色體8個,Ⅲ染色體5個。生理?xiàng)l件下進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)70個lncRNAs均不影響腸道干細(xì)胞的增殖;使用Prospero抗體染色篩選了15株整合果蠅株,均不影響腸道干細(xì)胞向EE細(xì)胞分化。DSS(dextran sulphate sodium)是葡聚糖的聚陰離子衍生物,喂食果蠅可造成腸道損傷,促使腸道干細(xì)胞增殖補(bǔ)充受損細(xì)胞。利用5%DSS喂食果蠅2天,發(fā)現(xiàn)CR43282敲除果蠅中腸道干細(xì)胞的數(shù)目與對照相比是減少的,表明在果蠅腸道再生條件下,CR43282影響腸道干細(xì)胞的增殖。根據(jù)lnc RNA敲除果蠅構(gòu)建原理繪制染色體定位圖,發(fā)現(xiàn)CR43282突變果蠅株同時敲除了CR43282和CR46040。隨后通過單只果蠅PCR及基因測序證實(shí)了該結(jié)果。為了反向驗(yàn)證CR43282和CR46040的功能,我們需要分別過表達(dá)CR43282和CR46040,所以構(gòu)建了CR43282和CR46040轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒。另一方面,通過PH3染色發(fā)現(xiàn)CR43282/CR46040敲除果蠅株ISC/EB細(xì)胞數(shù)目的減少是由于ISC的增殖受到抑制,表明腸道再生時CR43282/CR46040參與ISCs的增殖過程。lncRNA對果蠅腸道干細(xì)胞的調(diào)控還未有過報道,本研究通過對影響果蠅腸道干細(xì)胞增殖與分化的lnc RNAs的篩選,為進(jìn)一步揭示腸道干細(xì)胞增殖與分化的調(diào)控機(jī)理提供了幫助。
【圖文】：

圖 1 lncRNA 篩選策略示意圖。左邊為果蠅腸道干細(xì)胞分裂分化示意圖。ISC：腸道干細(xì)胞；EB：中間過渡細(xì)胞；EC：腸道表皮細(xì)胞；EE：腸內(nèi)分泌細(xì)胞；EEP,Pre-EE：EE 細(xì)胞的前體細(xì)胞。右邊是篩選 lncRNA 的簡要策略，，以及篩選出陽性 lncRNA的后續(xù)研究策略。

圖 2.1 X 染色體整合株構(gòu)建流程圖2.2.2 Ⅱ染色體整合株建立方法建立Ⅱ染色體整合株 esgGal4>lncX;UAS-DsRed，需要建立兩為 lncX;UAS-DsRed/TSTL 和 esgGal4,lncX/TSTL，然后二者雜
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Yanfen Lu;Zhouhua Li;;No Intestinal Stem Cell Regeneration after Complete Progenitor Ablation in Drosophila Adult Midgut[J];Journal of Genetics and Genomics;2015年02期

本文編號：2634208