本文關鍵詞：外排泵系統(tǒng)參與幽門螺桿菌適應克拉霉素壓力及耐藥過程的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp),是一種單極、多鞭毛的革蘭氏陰性細菌,寄生在胃粘膜上皮細胞的表面,很多人在兒童時期感染了幽門螺桿菌,而且很多人終生攜帶。幽門螺桿菌感染是慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1994年,世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構將幽門螺桿菌列為I級致癌原。因此,它的根除和感染治療成為人類需要面臨的重大科學問題。目前,國際上多采用三聯(lián)療法來治療臨床幽門螺桿菌的感染,克拉霉素(clarithromycin,CLR)是新一代的大環(huán)內酯類抗生素因其易吸收,且對胃酸穩(wěn)定,因此是治療幽門螺桿菌三聯(lián)療法常用的抗生素之一。最新的馬特里共識(latest Maastricht Consensus)已經將以克拉霉素為首的三聯(lián)療法列為根除幽門螺桿菌的首選療法。但是近年來由于克拉霉素的過量和反復使用,Hp對CLR的耐藥率國內外均呈上升趨勢,目前對克拉霉素耐藥機制的研究主要集中在Hp 23 S rRNA基因點突變的分析上。其他與克拉霉素耐藥的機制在國內外未見報道,但研究中發(fā)現(xiàn),許多Hp耐藥菌株的23S rRNA并未發(fā)生突變,這提示了可能23 S rRNA點突變不是產生耐藥的唯一因素,其耐藥機制需要進一步研究。外排泵系統(tǒng)由一系列膜蛋白組成,根據(jù)結構的不同,可以將其分為不同的家族。細菌耐藥性產生的機制有很多,包括鈍化酶的產生,藥物作用靶點的改變,膜通透性的改變,藥物代謝等。然而,耐藥產生最基本的機制是外排泵系統(tǒng)將藥物泵出胞外。只有逃過外排泵系統(tǒng)的作用,仍存留在細菌胞內的藥物,才會引起細菌其他的耐藥機制的產生。目前在幽門螺桿菌,已經有四種轉運蛋白被確認,這四種轉運蛋白均屬于RND家族,它們是Hp0605 to Hp0607; HefABC, Hp0971 to Hp0969; HefDEF, Hp1327 to Hp1329;HefGHI and Hp1489 to Hp1487,而且這些轉運蛋白已被報道參與幽門螺桿菌的耐藥。但是,構成Hp外排泵系統(tǒng)的轉運蛋白有很多,己被確認參與Hp耐藥調節(jié)的外排泵系統(tǒng)蛋白只有少數(shù),這些未被報道的外排泵系統(tǒng)蛋白是否參與幽門螺桿菌對克拉霉素的耐藥調節(jié)問題,需要我們進行進一步的研究。方法1.同源重組法在Hp26695菌株中構建Hp0939缺失突變株(△yckJ)2.通過在抗性平板連續(xù)傳代的方法體外誘導Hp26695敏感株產生CLR耐藥。3.微量肉湯稀釋法判定CLR最小抑菌濃度(MIC)。用MH肉湯將CLR做不同濃度稀釋后,再接種幽門螺桿菌,孵育后觀察細菌生長情況,以抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。4.基因芯片比較Hp26695野生株在受CLR刺激后及未受CLR刺激時外排泵系統(tǒng)基因表達差異。將未經CLR刺激的Hp26695野生株以及經過CLR刺激后的野生株分別做基因芯片檢測,通過兩組數(shù)據(jù)比較找出CLR壓力下表達情況變化最大的基因。5.Real-Time PCR法驗證基因芯片結果并對Hp0939基因的重要性作進一步鑒定。將野生株用CLR處理30min后,分別提取處理后及未作處理的RNA,并反轉錄為cDNA,運用Real-Time PCR檢測基因芯片篩選出的基因的表達。隨后,我們用不同濃度CLR分別刺激野生株不同時間,我們又用不同濃度的CLR刺激耐藥株,用同樣的方法提取RNA,反轉錄,運用Real-Time PCR檢測Hp0939、Hp1017基因的表達。6.平板菌落計數(shù)法,MIC測定以及熒光染色法比較Hp26695菌株及△yckJ經CLR處理后其生存率以及MIC的變化。結果1.成功體外誘導出Hp26695敏感株對CLR的耐藥株。2.CLR能夠引起Hp的嚴謹應答,多種外排泵系統(tǒng)蛋白參與Hp適應CLR的壓力過程。將未經CLR刺激的Hp26695野生株以及經過CLR刺激后的野生株分別做基因芯片檢測結果比較得出,在CLR刺激下,野生株Hp26695的外排泵系統(tǒng)轉運蛋白中,約有47個基因發(fā)生變化,其中變化較顯著的有24個(Fold(?)3)3.外排泵系統(tǒng)蛋白Hp0939參與Hp適應CLR過程。Real-Time PCR法驗證基因芯片結果發(fā)現(xiàn),外排泵系統(tǒng)基因Hp0939在Hp26695經CLR刺激后,表達量上調最顯著(P0.05),超過對照的100倍。除Hp0939外,Hp1017表達量上調僅次于Hp0939,超過對照50倍。為了初步驗證Hp0939的重要性,我們在Hp26695對CLR的耐藥株中檢測了Hp0939基因的表達,發(fā)現(xiàn)Hp0939在耐藥中表達也是增高的。隨后,我們用1.5MIC of CLR分別刺激野生株10min 20min 30min,并且分別用MIC 1.5MIC 2MIC of CLR刺激野生株30min,我們又用不同濃度的CLR刺激耐藥株,發(fā)現(xiàn)Hp0939的表達均有不同程度的增高。4.在野生株Hp26695上成功構建出Hp0939缺失突變株(△yckJ)5.Hp0939基因的缺失增加Hp對CLR的敏感性。我們構建了Hp0939基因的缺失突變株△yckJ,并通過MIC測定,平板菌落計數(shù)法,以及熒光染色法比較△yckJ與Hp26695經CLR處理后生存率以及MIC的變化。發(fā)現(xiàn),用3MIC的CLR分別處理兩種菌,△yckJ在處理4h后存活率降到1%以下,而Hp26695與前面結果一致,處理8h后存活率仍在10%以上；熒光染色結果顯示,3MIC的CLR處理后,△yckJ存活率較野生株明顯降低；同樣,通過對兩種菌株的MIC檢測發(fā)現(xiàn),△yckJ的MIC較野生株下降了87.5%。6.我們在Hp26695對CLR的耐藥株中檢測了Hp1017基因的表達,發(fā)現(xiàn)Hp1017在耐藥中表達也是增高的。隨后,我們用1.5MIC of CLR分別刺激野生株10min 20min 30min,并且分別用MIC 1.5MIC 2MIC of CLR刺激野生株30min,我們又用不同濃度的CLR刺激耐藥株,發(fā)現(xiàn)Hp1017的表達均有不同程度的增高。結論外排泵系統(tǒng)在Hp適應CLR過程中發(fā)揮重要作用,尤其是基因Hp0939(yckJ)的作用最為顯著,使得細菌抵抗抗生素CLR的損害,最終使得Hp快速適應CLR環(huán)境,為進一步耐受應答,耐藥株產生奠定了時間基礎和物質基礎。
【關鍵詞】：幽門螺桿菌 克拉霉素 外排泵系統(tǒng) yckJ
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-18
• 實驗材料與方法18-35
• 實驗結果35-38
• 討論38-42
• 結論42-43
• 本研究未完成工作43-44
• 附圖表44-57
• 參考文獻57-62
• 致謝62-64
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文64-65
• 附件65

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1 吳明慧;黃贊松;黃衍強;;幽門螺桿菌外排泵的研究進展[J];世界華人消化雜志;2013年17期

2 蔡興俊;吳華;黃奕江;莫濡冰;;泛耐藥銅綠假單胞菌外排泵表型分析[J];中國公共衛(wèi)生;2013年08期

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4 劉茜醇;王丹;何亞峰;陳未中;陳浩;;細菌的多藥耐藥外排泵[J];藥物生物技術;2013年02期

5 孫二琳,宋詩鐸,祁偉,郭慶蘭;嗜麥芽窄食單胞菌臨床株的多重耐藥外排泵的研究[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年09期

6 夏紅燈;徐元宏;;細菌外排機制及其抑制劑研究進展[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);2007年06期

7 孫二琳;;嗜麥芽窄食單胞菌外排泵的研究進展[J];國外醫(yī)學(微生物學分冊);2003年01期

8 潘愛珍;萬康林;;外排泵介導分枝桿菌耐藥性研究進展[J];中國人獸共患病學報;2009年10期

9 張曉梅;王蘇建;宋靜玉;魯科峰;王家平;;多藥耐藥鮑曼不動桿菌抗菌劑外排泵基因研究[J];國際檢驗醫(yī)學雜志;2011年16期

10 李顯志;;銅綠假單胞菌多重藥物耐藥性外排泵十年研究回顧(英文)[J];中國抗生素雜志;2012年07期

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1 吳春明;曹家麟;朱小區(qū);歐陽欽;宋建新;;多重耐藥銅綠假單胞菌主動外排泵基因檢測研究[A];第二屆傳染病診治高峰論壇暨2009年浙江省感染病、肝病學術年會論文匯編[C];2009年

2 劉永芳;呂曉菊;宗志勇;俞汝佳;高燕渝;陳慧莉;李曉芳;蔣勝;韓乾國;;銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥表型與外排泵表達水平的關系[A];中華醫(yī)學會全國第九次感染病學學術會議論文匯編[C];2006年

3 劉洋;楊錦紅;李方去;李向陽;;多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥表型與外排泵MexAB-OprM表達的關系[A];浙江省醫(yī)學會醫(yī)學微生物與免疫學及醫(yī)學病毒學學術年會論文匯編[C];2009年

4 劉永芳;呂曉菊;宗志勇;俞汝佳;高燕渝;陳慧莉;李曉芳;蔣勝;韓乾國;;銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥表型與外排泵表達水平的關系[A];第六屆全國抗菌藥物臨床藥理學術會議論文集[C];2006年

5 田偉;趙靜靜;鄧玉婷;劉健華;;動物源大腸桿菌多重耐藥外排泵基因oqxAB流行狀況調查[A];第十屆全國化療藥理暨抗感染藥理高峰論壇資料匯編[C];2010年

6 李翔;陳輝;漆涌;徐令清;伍勇;;銅綠假單胞菌外排泵及整合子在碳氫酶烯類耐藥中的作用[A];中華醫(yī)學會第七次全國檢驗醫(yī)學學術會議資料匯編[C];2008年

7 李向陽;;多重耐藥銅綠假單胞菌的耐藥表型與外排泵MexAB-OprM表達的關系[A];2009年浙江省檢驗醫(yī)學學術年會論文匯編[C];2009年

8 李亞明;劉原;潘雙;柯蕊;趙玉潔;;外排泵abeM及外膜蛋白與鮑曼不動桿菌多重耐藥性的相關性研究[A];中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2011（第十二次全國呼吸病學學術會議）論文匯編[C];2011年

9 謝青;趙麗霞;楊陽;劉安昌;周文;;多重耐藥菌株的主動外排系統(tǒng)[A];山東省藥學會第一屆學術年會論文集（下）[C];2005年

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1 劉憶霜;銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵抑制劑篩選模型的構建以及反義RNA、正向互補RNA對MexAB-OprM外排泵表達調控的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2009年

2 楊亮;銅綠假單胞菌中RND外排泵基因表達調節(jié)和功能研究[D];西北大學;2010年

3 龔鳳云;siRNA分子干擾銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵MexB基因表達的效應研究[D];華中科技大學;2012年

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2 路興曉;外排泵系統(tǒng)參與幽門螺桿菌適應克拉霉素壓力及耐藥過程的研究[D];山東大學;2015年

3 敖翔;主動外排泵對銅綠假單胞菌攝入硅納米顆粒的影響[D];中南大學;2008年

4 蔡興東;四種外排泵基因表達在多重耐藥銅綠假單胞菌中的分布及其作用[D];中南大學;2009年

5 陳元旺;細菌AcrAB-TolC外排泵在幽門螺桿菌耐藥中的作用及機制[D];南昌大學;2014年

6 劉永芳;銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性及其耐藥表型與外排泵表達的關系[D];四川大學;2006年

7 宗自衛(wèi);銅綠假單胞菌中RND外排泵基因調節(jié)及功能研究[D];西北大學;2007年

8 鐘海琴;連翹酯苷B對肺炎克雷伯菌外排泵活性的影響[D];寧波大學;2013年

9 曾博;RNA干擾和合成小分子對大腸桿菌外排泵抑制作用研究[D];四川農業(yè)大學;2008年

10 魏光;銅綠假單胞菌耐藥性分析及碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的相關研究[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

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本文編號：258490