【摘要】：中文摘要 背景(background):鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)分為致病性鉤體和非致病性鉤體兩大類。非致病性鉤端螺旋體存在于潮濕土壤和地表水中,屬于腐生性愿核細(xì)胞型微生物,不引起人或動(dòng)物疾病。致病性鉤體中目前至少確定有7種基因種,如Leptospira interrogans、Leptospira borgpetersenii、Leptospira kirschneri和Leptospira weilii等,其中問(wèn)號(hào)鉤體(L. interrogans)是流行最廣的致病性鉤體。由致病性鉤體感染引起的鉤體病是全球流行的人畜共患傳染病,好發(fā)于熱帶或亞熱帶國(guó)家或地區(qū),我國(guó)也是鉤體病主要疫區(qū)之一。致病性鉤體有強(qiáng)大的侵襲力,能迅速通過(guò)皮膚或黏膜侵入血流,引起中毒性敗血癥癥狀,如高熱、頭痛、肌痛等,鉤體隨血流侵入肺、肝、腎等臟器,引起肺出血、黃疸和腎功能損傷,常因呼吸或腎功能衰竭而導(dǎo)致死亡,其中肺彌漫性出血鉤體病死亡率高達(dá)50%以上。鼠類和家畜是鉤體主要?jiǎng)游锼拗?感染鉤體后雖無(wú)明顯癥狀,但可長(zhǎng)期甚至終身從尿液排出鉤體,污染土壤或水系成為疫源地。然而,鉤體不產(chǎn)生任何典型的外毒素,其脂多糖(LPS)毒性僅為大腸桿菌LPS的1/10～1/100,故鉤體毒力因子及其致病機(jī)制至今所知甚少。細(xì)菌膠原酶可以有效降解宿主結(jié)締組織及胞外基質(zhì)(extracellular matrix)中的膠原蛋白,是不少病原菌重要的侵襲性毒力因子之一。在問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中,含有一個(gè)膠原酶編碼基因(colA).如前所述,致病性鉤體有強(qiáng)大的侵襲力,但至今未見致病性鉤體膠原酶功能及其致病性的研究報(bào)道。 目的(aim)：了解鉤體膠原酶水解不同膠原蛋白底物能力及特異性、最佳工作pH和金屬離子濃度等酶動(dòng)力學(xué)特征,采用問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株膠原酶基因敲除突變株(colA)金地鼠感染模型,采用基因敲除技術(shù)了解鉤體膠原酶基因?qū)鸬厥蠖玖�、肺和肝及腎組織中鉤體載量及組織病變的影響,闡明鉤體膠原酶工作機(jī)制及其致病意義。 方法(methods):以我國(guó)流行最廣的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板,采用高保真PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)colA基因,T-A克隆后測(cè)序。以pET42a為表達(dá)載體、E.coli BL21DE3為表達(dá)宿主菌,構(gòu)建膠原酶原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli BL21DE3pET42a-colA采用0.5mM IPTG28℃誘導(dǎo)E.coli BL21DE3pET42a-colA表達(dá)重組ColA蛋白(rColA)、Ni-NTA親和層析柱提純r(jià)ColA,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查rColA表達(dá)情況及提純效果。采用多種膠原酶蛋白底物(多種膠原蛋白、Azocoll和Pz-肽)、不同pH和金屬離子及濃度緩沖液,了解鉤體重組膠原酶最佳膠原蛋白底物、pH和金屬離子及其濃度等酶動(dòng)力學(xué)特征。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Western Blot檢測(cè)感染問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)或人腎上皮細(xì)胞(HEK293)后colA基因表達(dá)水平變化及分泌情況。采用基于自殺質(zhì)粒的基因敲除技術(shù),構(gòu)建問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株膠原酶基因敲除突變株(colA-)。將不同濃度colA-突變株或野生株腹腔注射攻擊鉤體敏感動(dòng)物金地鼠,了解colA-突變株或野生株對(duì)金地鼠毒力差異(LD50)。采集colA-突變株與野生株感染金地鼠的肺、肝、腎組織標(biāo)本,固定、包埋、切片后分別HE和銀染色,觀察各組織標(biāo)本中鉤體載量及組織病變的差異。 結(jié)果(results):我們克隆的鉤體colA基因序列與GenBank中公布的問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株鉤體colA基因序列有很高的相似性。所構(gòu)建的鉤體colA基因原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli BL21DE3pET42a-colA能有效表達(dá)目的重組蛋白rColA, Ni-NTA親和層析柱純化的rColA經(jīng)SDS-PAGE后在凝膠中顯示為單一的蛋白條帶。rColA在37℃、pH7.4、0.4mM CaCl2-50mM Tris-HCl緩沖液中有最佳水解底物的效果,盡管rColA能在不同程度上水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白及Azocoll、Pz-肽廣泛的底物特異性,但最佳水解底物為Ⅲ型膠原蛋白。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株EMJH培養(yǎng)物上清中未檢出ColA蛋白,但感染人臍靜脈細(xì)胞(HUVEC)和人腎上皮細(xì)胞(HEK293)后colA-mRNA水平迅速升高并在感染細(xì)胞后6h達(dá)到峰值,問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株與HUVEC或HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)物上清中可檢出ColA蛋白。問(wèn)號(hào)鉤體賴株colA-突變株及野生株對(duì)金地鼠的LD50分別約為108和106。colA-突變株感染的金地鼠肺、肝、腎組織中鉤體載量明顯低于野生株,肺、肝、腎組織病變也明顯輕于野生株。 結(jié)論(conclusion):問(wèn)號(hào)鉤體黃疸出血群賴型賴株colA基因表達(dá)產(chǎn)物ColA是一種膠原酶,對(duì)不同膠原酶底物具有廣泛但不同程度的水解活性,但其最佳水解底物為Ⅲ型膠原蛋白。問(wèn)號(hào)鉤體賴株在體外培養(yǎng)基中不分泌ColA蛋白,但感染宿主細(xì)胞后ColA蛋白表達(dá)水平顯著升高并可外分泌。colA基因敲除的問(wèn)號(hào)鉤體賴株對(duì)金地鼠毒力明顯減弱,肺、肝和腎組織中鉤體載量顯著減少,組織病變程度也顯著下降。綜上所述,膠原酶ColA是在問(wèn)號(hào)鉤體致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用的毒力因子。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R377

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Expression and Comparative Analysis of Genes Encoding Outer Membrane Proteins LipL21,LipL32 and OmpL1 in Epidemic Leptospires[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年10期

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本文編號(hào)：2564822