【摘要】：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）是引起慢性肝臟疾病的主要原因之一，全世界約有1.7億HCV感染者，丙肝感染已成為全球性的、嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。HCV感染后，約50%～85%發(fā)展為慢性肝病，甚至肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌。目前，聚乙二醇干擾素-α和利巴韋林聯(lián)合應用是丙型肝炎治療的標準方案，其持續(xù)應答率只有50%，且副作用大，費用昂貴，停止治療后仍有很高的復發(fā)率。目前還沒有有效的抗HCV疫苗，所以研制預防性和治療性抗HCV疫苗很重要。 以抗原表位預測和人工合成抗原表位基因為基礎的多表位DNA疫苗是新型疫苗研究熱點。表位又稱抗原決定簇，是指免疫細胞能識別的抗原分子上的一個特定部位，可以和病毒的受體結(jié)合。重組多表位疫苗是指同時攜帶多個目標抗原相關表位以及輔助性表位的疫苗，它能有效地應付病原微生物的變異，克服主要組織相容性復合體(MHC)分子的遺傳限制，為特異性免疫治療和基因治療奠定了基礎。要獲得具有較強免疫原性的HCV多肽，廣泛地激發(fā)機體的CD8+T細胞介導的免疫反應，必須具有HCV不同區(qū)段的多個表位。我們利用生物信息學方法，用計算機預測出12條多肽，分別用每條肽體外刺激外周血單個核細胞，觀察其增殖情況，ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ水平的變化。結(jié)果顯示預測的HCV CTL表位NS4B(1793-1801)和P7（774-782）在體外能夠刺激T細胞反應。 樹突狀細胞是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原提呈細胞，是啟動、調(diào)控并維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)，其最大特點在于能夠激活初始型T細胞，啟動獲得性免疫，故是機體免疫應答的始動者，在免疫反應中起到舉足輕重的作用。目前，基因轉(zhuǎn)導DC制成的DC疫苗已成為研究的熱點。利用腺病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移，以其高效和良好的靶向性成為基因治療中常用的方法。 我們在此研究基礎上構(gòu)建含能表達這兩個HCV多CTL表位的DC疫苗，體外觀察其促進T細胞的反應和細胞毒殺傷效應，為抗HCV的DC疫苗研制打下基礎。 1．DC的體外培養(yǎng)和鑒定 全血來自于健康供者，經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），按CD14MicroBeads humanmonocyte kit(MACS)操作說明，分離收集CD14+單核細胞。用無血清培養(yǎng)液X-VIVO15調(diào)整CD14~+單核細胞密度為1×10~6cells/mL接種于24孔板，并加入GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)5%C02，37℃孵育培養(yǎng)5天，隔日半量換液，，第5天起加入成熟誘導因子TNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10ng/mL）、IL-6（10ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培養(yǎng)2天，即可誘導出成熟的樹突狀細胞。顯微鏡和流式細胞儀觀察和鑒定DC成熟狀態(tài)。 2．負載HCV多表位的腺病毒刺激DC 重組腺病毒表達質(zhì)粒AD1（多HCV表位）、AD2(陽性對照)和AD3（陰性對照）以50至1000感染復數(shù)（MOI）感染DC，于感染后48h熒光鏡下觀察細胞GFP的表達，應用流式細胞術（FCM）測定腺病毒介導基因轉(zhuǎn)染DC的效率。PCR和Western blot檢測DC細胞內(nèi)重組HCV多表位抗原基因序列的存在和表達。 3．DC體外刺激T細胞 收集感染重組腺病毒和未感染重組腺病毒的DC作為刺激細胞，取CD14-PBMC為效應細胞，進行混合淋巴細胞培養(yǎng)。ELISA檢測DC上清IL-12p70和混合淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ。用LDH釋放法檢測CTL活性。 結(jié)果： 1．DC呈半懸浮生長，胞體不規(guī)則增大，胞膜向外伸出呈樹枝樣突起。用流式細胞儀檢測不成熟DC、成熟DC和腺病毒感染DC的表面標志CD83、CD86、CD80和HLA-DR，結(jié)果顯示成熟DC和腺病毒感染DC比不成熟DC的表面標志表達明顯升高。 2．重組腺病毒有效感染DC，熒光鏡下細胞有GFP的表達。用特異性引物對重組腺病毒感染24h后DC的總RNA進行PCR，，結(jié)果顯示在150bp處有特異性擴增條帶，其大小與目的基因大小相符。用鼠抗FLAG抗體為一抗， HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，對重組腺病毒感染48h后DC的總蛋白進行Western blot分析，結(jié)果可見大小約為10KD的蛋白，這與預計的序列1-FLAG和序列2-FLAG融合蛋白大小一致，表明DC成功表達出序列1和序列2蛋白。 3．DC能刺激T細胞增殖，腺病毒感染DC分泌IL-12p70增多，其刺激T細胞分泌IFN-γ增多。重組多CTL表位腺病毒感染的DC可誘導特異性的細胞免疫應答。 綜上所述，重組多CTL表位腺病毒在體外能有效感染DC，促進T細胞反應，為下一步抗HCV的DC疫苗研制打下基礎。
【圖文】：

一、HCV 感染的后免疫應答HCV 基因組有 9.6kb，編碼 3010aa 的多肽，由結(jié)構(gòu)蛋白（Core、E1 和E2）和 7 個非結(jié)構(gòu)蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）組成[1](圖 1)。

在持續(xù) HCV 基因組復制過程中，盡管有強烈的 CD8+T 細胞反應，許多 T 細胞表位是完整的且不發(fā)生變異[4]。這些觀察表明，突變逃避不是逃避抗原特異性 T 細胞的唯一機制。表明有多個互補的途徑如功能性無能和調(diào)節(jié)性 T 細胞群的生成，導致病毒持久維持[5]（圖 2）。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392


本文編號：2555620