【摘要】：研究背景 隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的變化，冠心病(Coronary HeartDisease, CHD)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，特別是心肌梗死近期和遠(yuǎn)期并發(fā)癥不僅威脅人類(lèi)生命，還嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量。雖然，有研究表明心肌梗死發(fā)生后部分心肌細(xì)胞有分裂增殖的現(xiàn)象，但僅1%的更新率難以彌補(bǔ)損失的心肌細(xì)胞數(shù)量，對(duì)心功能的改善作用甚微。目前臨床治療冠心病心梗主要集中于挽救非梗死區(qū)的心肌細(xì)胞，改善心功能。但不管是藥物治療還是介入治療，或是外科心臟搭橋手術(shù)都不能恢復(fù)梗死區(qū)的心臟功能，所以嚴(yán)重心梗的患者死亡率仍然很高。修復(fù)梗死區(qū)心肌細(xì)胞成為臨床醫(yī)生和醫(yī)學(xué)科學(xué)家亟待解決的難題。近年來(lái)，很多關(guān)于干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞修復(fù)梗死區(qū)心肌細(xì)胞以改善心臟功能的研究為冠心病的進(jìn)一步治療帶來(lái)希望。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)用于治療冠心病心肌梗死的前臨床研究已經(jīng)取得令人鼓舞的進(jìn)展，但如何解決誘導(dǎo)分化率低的問(wèn)題是目前需要突破的瓶頸。隨著研究的深入，干細(xì)胞治療冠心病將會(huì)為患者帶來(lái)良好的獲益。 研究目的 1.探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）體外分離培養(yǎng)及純化方法。 2.探索BMP-2誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法及效果。 3.探索BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）向心肌樣細(xì)胞分化的作用。 研究方法 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）的體外分離及培養(yǎng)：取大鼠四肢長(zhǎng)骨骨髓，采用密度梯度離心法結(jié)合差速貼壁法分離骨髓內(nèi)的BMMSCs，傳代培養(yǎng)以純化細(xì)胞。取第4代BMMSCs用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面抗原CD29、CD44、CD45檢測(cè)。倒置相差顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并拍照記錄。 2. BMP-2誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化：取第4代BMMSCs誘導(dǎo)24h后換液。實(shí)驗(yàn)分組為：空白對(duì)照組(Control)和BMP-2組(10μg/L)。Western Blot檢測(cè)2w和4w縫隙連接蛋白43(CX43)及心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的表達(dá)。免疫熒光染色鑒定BMP-2誘導(dǎo)4w后分化為心肌樣細(xì)胞的cTn I和CX43表達(dá)情況。 3. BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化：取第4代BMMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組(Control)、5-AZA組(10μmol/L)、BMP-2組(10μg/L)、BMP-2+5-AZA組(10μg/L+10μmol/L)。前3組誘導(dǎo)24h后換完全培養(yǎng)液，聯(lián)合誘導(dǎo)組共誘導(dǎo)48h后換完全培養(yǎng)液。誘導(dǎo)終止后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。培養(yǎng)4w后免疫熒光染色鑒定細(xì)胞cTnI、CX43蛋白的表達(dá)；Western Blot法檢測(cè)cTn I、CX43蛋白表達(dá)量的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各誘導(dǎo)組MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的分化率。 研究結(jié)果 1.大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征：原代BMMSCs體積小，胞核較小，形態(tài)多樣，，主要為短梭形，還有橢圓形、星形、不規(guī)則形，有大小、長(zhǎng)短不等的突起伸出胞體。1w后細(xì)胞呈集落樣成長(zhǎng)，排列規(guī)則，可見(jiàn)到漩渦樣結(jié)構(gòu)。傳代后的細(xì)胞體積變大，排列不規(guī)則，核漿比變大，形態(tài)不均，排列紊亂。流式細(xì)胞儀BMMSCs表面抗原鑒定結(jié)果為：CD29陽(yáng)性表達(dá)率為(94.4±3.59)%，CD44陽(yáng)性表達(dá)率為(88.4±1.51)%，CD45陽(yáng)性表達(dá)率為(2.6±0.40)%。 2. BMP-2誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化：倒置相差顯微鏡下Control組細(xì)胞無(wú)明顯變化；BMP-2組細(xì)胞體積及核漿比明顯增大，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，生長(zhǎng)方向隨著時(shí)間延長(zhǎng)趨于一致、排列規(guī)則、細(xì)胞間連接緊密，4w時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)肌島樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色提示：4w時(shí)可見(jiàn)BMP-2組細(xì)胞cTn I和CX43表達(dá)，Control組未見(jiàn)cTn I表達(dá)，僅有少量CX43表達(dá)。WesternBlot檢測(cè)cTn I及CX43蛋白表達(dá)水平，2w時(shí)BMP-2組cTn I及CX43有少量表達(dá)；4w時(shí)BMP-2組cTn I及CX43表達(dá)增強(qiáng)，明顯高于2w時(shí)的表達(dá)。 3. BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導(dǎo)BMMSCs向心肌樣細(xì)胞分化：流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組誘導(dǎo)終止后活細(xì)胞數(shù)百分比，結(jié)果顯示5-AZA組活細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(45.23±5.73)%，BMP-2組活細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(73.56±3.78)%,BMP-2+5-AZA組活細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(68.75±6.82)%。倒置相差顯微鏡下細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化：除Control組細(xì)胞無(wú)明顯變化外；各組細(xì)胞形態(tài)均明顯變大、呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核增大，細(xì)胞間聯(lián)系緊密，細(xì)胞排列一致、生長(zhǎng)趨于集中，4w時(shí)形成肌島樣結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色提示：誘導(dǎo)2w時(shí)Control組未見(jiàn)cTn I表達(dá)，其余3組均可見(jiàn)少量表達(dá)；4w時(shí)Control組仍未見(jiàn)表達(dá)，其余3組cTn I表達(dá)均明顯較2w時(shí)增強(qiáng)，且聯(lián)合誘導(dǎo)組表達(dá)高于5-AZA組和BMP-2組。Western Blot檢測(cè)cTnI及CX43蛋白表達(dá)水平，2w時(shí)Control組微弱表達(dá)，其余三組有少量表達(dá)；4w時(shí)Control組仍表達(dá)微弱，其余三組cTn I及CX43表達(dá)明顯增強(qiáng)，分別與Control組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)；聯(lián)合誘導(dǎo)組明顯高于5-AZA組和BMP-2組，組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)，4w與2w組內(nèi)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌樣細(xì)胞分化率：結(jié)果顯示，空白對(duì)照組FITC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(2.05±0.39)%；5-AZA組FITC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(23.78±1.53)%； BMP-2組FITC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(17.53±1.06)%；BMP-2+5-AZA組FITC標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)(27.99±2.01)%。5-AZA組、BMP-2組和BMP-2+5-AZA組與Control組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。 研究結(jié)論 1. BMP-2和5-AZA聯(lián)合誘導(dǎo)提高BMMSCs分化率達(dá)(27.99±2.01)%，且細(xì)胞死亡率明顯低于5-AZA單獨(dú)誘導(dǎo)組，是一種安全高效的誘導(dǎo)分化方法。 2.BMP-2可以誘導(dǎo)BMMSCs分化為心肌樣細(xì)胞并表現(xiàn)相應(yīng)生物學(xué)特征，但分化率為(17.53±1.06)%，效果不優(yōu)于單純5-AZA誘導(dǎo)。 3.采用密度梯度離心與差速貼壁相聯(lián)合的分離方法可以獲得BMMSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第4代BMMSCs表面抗原證實(shí)可以獲得高純度BMMSCs。
【圖文】：

圖 1 光學(xué)顯微鏡下 BMMSCs 形態(tài)學(xué)變化a: 即刻分離的BMMSCs (×100); b: 原代培養(yǎng)3 d的BMMSCs (×100);c: 原代培養(yǎng)7 d的BMMSCs (×100); d: 第4 代BMMSCs (×100).3.2 BMMSCs 聯(lián)合表面抗原鑒定結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè) BMMSCs 表面陽(yáng)性抗原 CD29、CD44 和陰性 CD45，結(jié)果顯示：CD29 陽(yáng)性表達(dá)率為(94.4±3.59)%，CD44 陽(yáng)性表達(dá)率為(88.4±1.51)%，CD45 陽(yáng)性表達(dá)率為(2.6±0.40)%。（圖 2）。結(jié)果表明采用密度梯度離心與差速貼壁聯(lián)合法分離獲得大鼠 BMMSCs，經(jīng)傳代培養(yǎng)，可得到純化的 BMMSCs。

-32-圖 2 BMMSCs 表面抗原表達(dá)a. BMMSCs 表達(dá) CD29 流式圖 b. BMMSCs 表達(dá) CD44 流式圖；c. BMMSCs 表達(dá) CD45 流式圖 d. BMMSCs 表達(dá) CD29、CD44、CD45 統(tǒng)計(jì)圖4 討 論成體組織干細(xì)胞有自我更新即再生潛能，在一定條件下可以向多種細(xì)胞分化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在適宜環(huán)境和一定細(xì)胞因子存在的條件下可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞等。BMMSCs 作為種子細(xì)胞移植之前，需要連續(xù)培養(yǎng)多代以獲得足夠量的細(xì)胞來(lái)修復(fù)器官損傷。MSCs 具有多能干細(xì)胞共同的特點(diǎn)，廣泛存在于人體的各個(gè)器官，如
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R329

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本文編號(hào)：2520641