本文關鍵詞：人廢棄胚胎單卵裂球體外發(fā)育研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：對胚胎卵裂球拆分,形成單卵裂球并培養(yǎng)獲得妊娠在動物實驗中已有報道。由于早期胚胎具備全能性,因此從胚胎中分離單個卵裂球使其細胞數(shù)增多甚至發(fā)育成囊胚成為可能。胚胎分割成為卵裂球后培養(yǎng)獲得的囊胚和分割前的胚胎相比,具備了相同的基因組信息,體外培養(yǎng)獲得的新的胚胎,移植后獲得的個體基因型必然完全相同,如果發(fā)育順利,就可以憑借這種方法得到與分割前胚胎基因型完全一致的個體,也就實現(xiàn)了以有限的資源而獲得大量的擴增。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子在雌性動物的生殖道內(nèi)合成,并且與嚙齒動物、家畜等移植前胚胎的生長發(fā)育密切相關,動物實驗提示粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子可以作為胚胎繼續(xù)發(fā)育的“存活因子”。小鼠移植前的胚胎可表達GM-CSF受體的α-鏈,向培養(yǎng)液中加入重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子對小鼠卵裂期胚胎生長發(fā)育、囊胚的形成以及后續(xù)的貼壁粘附有利。因此卵裂球的體外培養(yǎng)成為實現(xiàn)上述資源擴增的基礎,本研究首先以捐贈的胚胎為基本材料,探討了培養(yǎng)液配置時間、卵裂球培養(yǎng)時間、液滴的體積對卵裂球發(fā)育能力的影響,從而得到了此時卵裂球的最佳培養(yǎng)條件,然后在此條件下,以冷凍胚胎為材料,獲得了最適的重組粒-巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony stimulating factor,rhGM-CSF)濃度,最后以此最適細胞因子濃度的培養(yǎng)液為基礎,對來源于捐贈的新鮮第三天劣質胚胎的單卵裂球培養(yǎng),并獲得良好效果。最佳卵裂球體外培養(yǎng)條件的得出,為后續(xù)干細胞培養(yǎng)以及干細胞建系等提供了前期的實驗基礎。為得出最佳的卵裂球體外培養(yǎng)條件,將解凍的120個優(yōu)質胚胎采用激光破除透明帶后,獲得863個卵裂球,單獨培養(yǎng)至第六天。(探討微滴體積10ul、20ul、30u、40ul對卵裂球后期發(fā)育的影響(40個胚胎,339個卵裂球)。(探討培養(yǎng)液平衡時間分別為2h、4h、20h、24h對卵裂球后期發(fā)育的影響(40個胚胎,334個卵裂球)。(探討卵裂球的培養(yǎng)時間分別為D3、D4、D5、D6對卵裂球后期發(fā)育的影響(40個胚胎,340個卵裂球)。比較各組的單卵裂球分裂率、致密化率和囊胚形成率。探討卵裂球的培養(yǎng)時間對卵裂球發(fā)育的影響時,還需另討論培養(yǎng)至最后一天剩余的囊胚數(shù)。結果依卵裂球體外培養(yǎng)形成囊胚的數(shù)目的多少來看,當微滴體積20ul、培養(yǎng)時間是D3、液體平衡20h時囊胚形成率最高,因此得到最佳培養(yǎng)條件為微滴體積20ul、培養(yǎng)時間是D3、液體在解凍前20小時配置。為探索單卵裂球培養(yǎng)所需的rhGM-CSF濃度,以0.2ng/ml、0.4ng/ml、0.6ng/ml、 0.8ng/ml、1.0ng/ml分組,共解凍了46枚胚胎,應用所得的最佳培養(yǎng)條件對單卵裂球行囊胚培養(yǎng),結果顯示,0.4ng/ml組雖然卵裂球的分裂率不是最高,但是致密化率和囊胚形成率均得到最大,囊胚計數(shù)結果顯示,0.4ng/ml組平均每個囊胚的細胞數(shù)目最多為30.36±12.75,顯著高于0.2ng/ml組和0.6ng/ml組。與空白對照組相比,0.4ng/ml的rhGM-CSF顯著提高了單卵裂球的分裂率以及囊胚形成率。為了研究細胞因子對劣質胚胎(均為Ⅳ級胚胎)的作用效果,本研究挑選了取卵后的第三天的胚胎,實驗組添加細胞因子20枚胚胎,對照組不添加任何物質的空白培養(yǎng)液10枚胚胎,結果顯示,實驗組的卵裂球分裂率、致密化以及囊胚形成率均顯著上升。
【關鍵詞】：胚胎分割 單卵裂球 體外培養(yǎng) 重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子
【學位授予單位】：西南交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 課題來源13
• 1.2 研究背景及文獻綜述13-22
• 1.2.1 人類胚胎體外培養(yǎng)發(fā)展史13-14
• 1.2.2 單卵裂球與發(fā)育14
• 1.2.3 胚胎最適培養(yǎng)條件14-17
• 1.2.4 細胞因子與卵裂球的體外培養(yǎng)17-19
• 1.2.5 胚胎質量與發(fā)育19
• 1.2.6 本研究中使用到的方法19-21
• 1.2.7 卵裂球體外培養(yǎng)意義21
• 1.2.8 卵裂球體外培養(yǎng)存在的問題21-22
• 1.3 本研究的主要流程以及意義22-23
• 第2章 單卵裂球培養(yǎng)條件的初步探索23-35
• 2.1 實驗材料、儀器及試劑23-24
• 2.1.1 實驗材料23
• 2.1.2 實驗試劑23-24
• 2.1.3 實驗儀器24
• 2.2 實驗方法24-27
• 2.2.1 所需溶液的配置24-25
• 2.2.2 胚胎分級標準25
• 2.2.3 胚胎解凍25-26
• 2.2.4 單卵裂球的獲得26-27
• 2.2.5 評價指標27
• 2.2.6 結果的計算27
• 2.3 試驗設計27-29
• 2.3.1 微滴體積對單個卵裂球發(fā)育的影響27
• 2.3.2 培養(yǎng)時間對單卵裂球發(fā)育的影響27-28
• 2.3.3 液體的平衡時間對卵裂球發(fā)育的影響28-29
• 2.4 數(shù)據(jù)處理29
• 2.5 實驗結果及結論29-32
• 2.5.1 解凍的胚胎構成29-30
• 2.5.2 結果30-32
• 2.6 討論32-33
• 2.7 小結33-35
• 第3章 外源細胞因子RHGM-CSF對卵裂球的作用35-44
• 3.1 實驗材料、儀器及試劑35
• 3.1.1 實驗材料35
• 3.1.2 實驗儀器35
• 3.1.3 實驗試劑35
• 3.2 試驗方法35-37
• 3.2.1 所需溶液的配制35-36
• 3.2.2 囊胚的Hoechst33342法染色36
• 3.2.3 試驗設計36-37
• 3.3 數(shù)據(jù)分析37
• 3.4 結果37-41
• 3.5 討論41-43
• 3.6 小結43-44
• 第4章 細胞因子應用于劣質新鮮胚胎單個卵裂球體外培養(yǎng)44-49
• 4.1 試驗材料、儀器及試劑44
• 4.1.1 試驗材料44
• 4.1.2 試驗儀器及試劑44
• 4.2 試驗方法44-45
• 4.2.1 胚胎的來源44
• 4.2.2 液體配置44
• 4.2.3 實驗設計44-45
• 4.3 數(shù)據(jù)分析45-46
• 4.4 實驗結果46-47
• 4.5 討論47-48
• 4.6 小結48-49
• 結論49-51
• 致謝51-52
• 參考文獻52-56
• 附錄56-59
• 攻讀碩士期間的主要成果59

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本文編號：251512