發(fā)布時(shí)間：2019-07-16 07:09

【摘要】：雙歧桿菌在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、抑制病原微生物的侵入、抗腫瘤、抗突變和抗衰老等方面具有重要的作用。雙歧桿菌對(duì)腸黏膜上皮細(xì)胞的黏附和定植是其發(fā)揮生理作用的前提,也是評(píng)價(jià)其作為微生態(tài)活菌制劑的一個(gè)重要指標(biāo)。 本文主要探究了黏附蛋白BIF在雙歧桿菌屬中的分布,探求了長(zhǎng)雙歧桿菌未知功能的黏附蛋白的存在。即：1、通過分子克隆表達(dá)技術(shù)獲得了長(zhǎng)雙歧桿菌黏附蛋白BIF,并從四株雙歧桿菌中獲得了類BIF蛋白的基因和蛋白；2、以磁性納米材料為載體,直接篩選獲得了黏附腸上皮細(xì)胞的長(zhǎng)雙歧桿菌的表面蛋白；3、對(duì)上述蛋白體外黏附腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能進(jìn)行了初步研究。 有關(guān)論文的詳細(xì)內(nèi)容分述如下。 益生菌和致病菌的黏附是影響宿主健康的重要步驟。本文綜述了近年來益生菌及致病菌對(duì)腸道上皮細(xì)胞黏附機(jī)制的研究進(jìn)展,比較了其黏附后的生物學(xué)效應(yīng)差異,重點(diǎn)對(duì)兩者之間的競(jìng)爭(zhēng)性黏附作用進(jìn)行了概述。在上述基礎(chǔ)上對(duì)益生菌抑制致病菌的研究前景和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。 雙歧桿菌的黏附蛋白BIF在益生菌中的分布及功能差異鮮有報(bào)道,為此本文開展了較為詳細(xì)的研究。首先,本文以長(zhǎng)雙歧桿菌的BIF為研究對(duì)象,成功構(gòu)建了pBIF-GEX重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后誘導(dǎo)表達(dá),GST親和柱純化,獲得了高純度的BIF蛋白。量子點(diǎn)標(biāo)記,BIF蛋白證實(shí)了其與腸上皮細(xì)胞HT-29的黏附。平板計(jì)數(shù)法驗(yàn)證了BIF對(duì)單核增生李斯特菌和大腸桿菌O157：H7黏附HT-29具有明顯的抑制作用,而對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌和植物乳桿菌的黏附?jīng)]有顯著影響。50μg/mL的BIF能使單核增生李斯特菌的黏附率從41.6%降到8.6%,大腸桿菌0157：H7從44.3%降到10.4%；BIF濃度對(duì)HT-29細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4、IL-8的產(chǎn)生呈正相關(guān),而對(duì)TNF-a無顯著影響。 為從益生菌中獲得BIF或類BIF的基因和蛋白,本文制備了抗BIF蛋白的鼠源多克隆抗體,通過斑點(diǎn)雜交法篩選,證實(shí)了嬰兒雙歧WBIN03,嬰兒雙歧WBAN07,青春雙歧WBAD08,乳雙歧WLABO9存在BIF蛋白。以bif-F1、bif-R1為引物,驗(yàn)證了上述4株雙歧桿菌中bif基因的存在,bif基因與bif基因的同源率分別達(dá)到89.71%、82.53%、90.75%和82.91%。類似地,克隆表達(dá)的這四種BIF蛋白中有三種BIF類似蛋白被證實(shí)對(duì)腸上皮細(xì)胞有黏附功能。 探求未知功能的雙歧桿菌黏附蛋白是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的研究。為此,本文采用了磁珠偶聯(lián)腸上皮細(xì)胞碎片,與長(zhǎng)雙歧桿菌膜蛋白相互作用的策略,分離了4種黏附相關(guān)蛋白。經(jīng)質(zhì)譜測(cè)序、生物信息學(xué)分析,獲得了完整的蛋白序列和基因序列。同樣,經(jīng)克隆表達(dá)、量子點(diǎn)標(biāo)記,發(fā)現(xiàn)這四種蛋白中的三種對(duì)HT-29細(xì)胞有黏附功能。其中PP1對(duì)HT-29細(xì)胞因子IL4、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生有顯著影響。 綜上所述,探究益生菌的黏附蛋白和相關(guān)基因,在細(xì)胞水平上研究益生菌對(duì)致病菌的黏附拮抗以及對(duì)腸上皮細(xì)胞產(chǎn)細(xì)胞因子的影響,對(duì)提高我國(guó)在益生菌研究領(lǐng)域的分子研究水平,為功能基因和功能蛋白在微生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。采用磁珠法獲得益生菌的黏附蛋白,通過量子點(diǎn)標(biāo)記驗(yàn)證其黏附功能,是益生菌功能研究方面的一種創(chuàng)新。本研究將為今后開展益生菌的功能基因和蛋白的研究,提供一種方法學(xué)和新的思路。
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圖片說明： 第二章長(zhǎng)雙歧桿菌BIF的克隆表達(dá)及功能驗(yàn)證雙歧桿菌DNA提取結(jié)果如圖2.1所示。Mr(卜l，) 2313094!66557436)23222027圖2.1基因組ONA電泳圖譜說明:l，入一 HindIITdigest;2，長(zhǎng)雙歧桿菌叢因組DNA Figure2.1PatternofeleetroPhoresisofgenornieDNAofB.long:‘mNote:1，，入一 Hind111digest:2， GenomieDNAofB.long:一nZ實(shí)驗(yàn)表明，基因組DNA的大小約為 23000bp，其提取效果較好，無明顯的降解現(xiàn)象
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圖片說明： 23222027圖2.1基因組ONA電泳圖譜入一HindIITdigest;2，長(zhǎng)雙歧桿菌叢因組DNAernofeleetroPhoresisofgenornieDNAofB.long一Hind111digest:2，GenomieDNAofB.long:一nZNA的大小約為23000bp，其提取效果較驗(yàn)。增WBLO01(B.tongllnZWBLO01)中發(fā)現(xiàn)b了基因，其PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2.2所皿ATGACAGTI…AAGATTGGTATCAACG送邏TCACTCGGAGATCTCAGCGA一3
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R371

【參考文獻(xiàn)】

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1 葉若松;雙歧桿菌絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆表達(dá)及功能的初步研究[D];南昌大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2514916