【摘要】：【研究背景】周圍神經(jīng)缺損后移植修復常以犧牲供區(qū)神經(jīng)為代價,以雪旺細胞為基礎的組織工程神經(jīng)研究為周圍神經(jīng)損傷的修復帶來新選擇,卻同樣不可避免損傷另一條神經(jīng)。避開胚胎干細胞的倫理學障礙,誘導成體干細胞分化為類雪旺細胞(Schwann cell-like cell lineages,SCs-like)進行組織工程神經(jīng)研究,正受到廣泛關(guān)注。肌源性干細胞(muscle-derived stem cells,MDSCs)是一類新近發(fā)現(xiàn)的成體干細胞,具有干細胞的一般特性。肌源性干細胞多系統(tǒng)分化潛能表現(xiàn)為經(jīng)誘導可分化為骨、軟骨細胞、血管內(nèi)皮細胞、造血干細胞、脂肪細胞等,自我更新能力表現(xiàn)為經(jīng)過30次傳代培養(yǎng)后能保持初始的細胞表型及基因組構(gòu)成。具有移植免疫優(yōu)越性是肌源性干細胞的獨特優(yōu)勢。肌源性干細胞日益被應用到骨骼、肌肉等組織的再生醫(yī)學研究中,已有動物體內(nèi)實驗研究表明MDSCs能促進肌纖維的再生、增強再生肌組織的功能,并能少量分化為神經(jīng)外膜組織和具有雪旺細胞(Schwann cells,SCs)表型的細胞。后者為組織工程神經(jīng)研究尋找新的類雪旺細胞作為種子細胞帶來可能。近年人源肌源干細胞(human muscle-derived stem cells,h-MDSCs)的成功分離拉近了肌源干細胞與再生醫(yī)學臨床應用之間的距離。 【目的】(1)掌握顯微鏡下小鼠肌組織分離和肌源干細胞分離過程中三重酶消化和細胞篩過濾方法,應用改良的差速貼壁法從小鼠肌組織分離得到肌源干細胞,應用有限稀釋技術(shù)培養(yǎng)肌源干細胞單細胞克隆和亞克隆集落;(2)從重瞼成形術(shù)廢棄的組織中尋找可供利用的健康肌組織,并分析其作為科學研究用途的合理性;(3)借鑒小鼠肌源干細胞分離方法,建立從人眼輪匝肌組織分離人源肌源干細胞的方法,為人成體干細胞的研究提供新的組織分離來源,并分析其獲取方法從“微創(chuàng)”到“無創(chuàng)”的進步;(4)從大鼠坐骨神經(jīng)獲取雪旺細胞進行原代和傳代培養(yǎng),制備雪旺細胞條件培養(yǎng)液;(5)將人源肌源干細胞與雪旺細胞條件培液共培養(yǎng),誘導人源肌源干細胞向雪旺細胞方向分化,為組織工程神經(jīng)研究尋找可能的種子細胞替代物。 【方法】(1)顯微鏡下依次剝離骨、軟骨和神經(jīng)血管組織,獲得較為單一的小鼠肌組織;經(jīng)過膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化,繼以100目、200目和400目細胞篩過濾,得到富含肌源干細胞的細胞懸液;通過改良差速貼壁法的首次貼壁時間為1小時,分離和培養(yǎng)小鼠肌源干細胞,相差顯微鏡下觀察歷次貼壁細胞和肌源干細胞的細胞形態(tài)和生長狀態(tài);通過有限稀釋技術(shù)培養(yǎng)肌源干細胞單細胞克隆和亞克隆集落,描繪細胞克隆生長曲線;應用免疫組織化學染色法標記肌源干細胞表面Desmin和Sca-1,鑒定其細胞來源和表面干細胞特異標記物;(2)2010年7月至2010年11月間,選擇三名行重瞼成形術(shù)的女性患者作為志愿者(年齡19-24周歲)。志愿者在第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院整形外科接受切開法重瞼成形術(shù)后,收集志愿者提供的眼輪匝肌,進行數(shù)據(jù)測量并轉(zhuǎn)移至實驗室。通過與獲取人體健康組織的常見方法比較,分析重瞼成形術(shù)中獲取眼輪匝肌作為研究對象的合理性;(3)借鑒小鼠肌源干細胞分離方法,鏡下依次去除附著于肌組織的筋膜組織和神經(jīng)血管組織,獲得較為單一的眼輪匝肌組織;經(jīng)膠原酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三重消化,繼以100目、200目和400目細胞篩過濾,得到富含人源肌源干細胞的細胞懸液;通過差速貼壁去除成纖維細胞,分離和培養(yǎng)人源肌源干細胞,相差顯微鏡下觀察人源肌源干細胞的細胞形態(tài)和生長狀態(tài);應用免疫組織化學染色法鑒定人源肌源干細胞表面Desmin和Sca-1,鑒定其細胞來源和表面干細胞特異標記物;通過與人成體干細胞常見分離方法的比較,分析該方法“無創(chuàng)”的優(yōu)越性;(4)獲取新生大鼠坐骨神經(jīng),顯微鏡下去除神經(jīng)外膜,胰蛋白酶消化后,進行雪旺細胞的的原代和傳代細胞培養(yǎng),通過免疫組織化學染色法鑒定雪旺細胞并分析細胞純度;通過半量換液,收集雪旺細胞條件培液;(5)通過與雪旺細胞條件培液共培養(yǎng),誘導人源肌源干細胞向雪旺細胞方向分化,相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài),免疫組織化學染色法標記誘導分化后細胞表面的雪旺細胞特異標記物S100,GFAP和p75。 【結(jié)果】(1)通過應用改良的差速貼壁法和有限稀釋技術(shù),從小鼠肌組織成功分離培養(yǎng)出肌源干細胞,光鏡下觀察細胞呈現(xiàn)典型的短梭形和小圓形形態(tài)特征,呈現(xiàn)集落樣生長,增殖速度快,未發(fā)生分化。免疫組織化學染色顯示細胞均呈現(xiàn)Desmin陽性染色,Sca-1陽性染色,Sca-1陽性率為92.3±4.1%;(2)收集三名接受重瞼成形術(shù)的患者志愿提供的雙側(cè)上瞼眼輪匝肌共6條,雙側(cè)眼輪匝肌濕重合計156-241mg之間,達到分離細胞所需的組織量;(3)從眼輪匝肌中分離和培養(yǎng)人源肌源干細胞,光鏡下觀察細胞呈現(xiàn)典型的短梭形和小圓形形態(tài)特征,增殖速度快,未發(fā)生分化。免疫組織化學染色顯示細胞均呈現(xiàn)Desmin陽性染色,Sca-1陽性染色,Sca-1陽性率為81.8±2.4%;(4)成功分離大鼠坐骨神經(jīng)來源的雪旺細胞,進行細胞原代和傳代培養(yǎng),免疫組織化學染色法標記雪旺細胞表面S100蛋白,顯示S100染色陽性,陽性率為97.4±0.7%;通過半量換液,制備雪旺細胞條件培液;(5)成功誘導人源肌源干細胞向雪旺細胞方向分化,免疫組織化學染色法標記分化后類雪旺細胞表面特異標記物S100,GFAP和p75,染色結(jié)果顯示陽性,陽性率分別為65.1±3.4%,23.3±1.7%和30.3±5.2%。 【結(jié)論】(1)應用改良的差速貼壁法,可從小鼠肌組織中分離得到肌源干細胞;(2)借鑒小鼠肌源干細胞的分離培養(yǎng)方法,可從人眼輪匝肌分離得到人源肌源干細胞,增加了肌源干細胞的分離來源,為人源成體干細胞的研究提供了新的細胞來源;(3)應用雪旺細胞條件培液可誘導人源肌源干細胞分化為類雪旺細胞,為組織工程神經(jīng)研究尋找到新的種子細胞替代物;(4)諸如重瞼成形術(shù)等美容整形手術(shù)可為組織工程和再生醫(yī)學的基礎研究和潛在臨床應用提供更為合理的人體健康組織和成體干細胞來源。
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圖片說明： 第二軍醫(yī)大學博士學位論文圖1-1 相差顯微鏡下MDSCs分離過程中貼壁的pp1-pp5細胞貼壁細胞生長一周時形態(tài)記錄。圖A，B，C 為 pp1 貼壁生長一周后不同倍數(shù)下的形態(tài)記錄，依次至圖 M，N，O 為 pp5。pp1 約半數(shù)以上細胞為不規(guī)則的成纖維細胞和上皮細胞（圖 A），一周時成熟肌細胞結(jié)構(gòu)破壞，可見明顯增大的細胞核（圖 C），pp2、pp3 和 pp4 除少量細胞外均為肌性來源
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圖片說明： 圖 1-4 相差顯微鏡下培養(yǎng) 2 周的 MDSCs、MDSC 單克隆和 MDSCs 亞克隆生長狀態(tài)和細胞形態(tài)特征。圖 A 示兩個相鄰 MDSCs 集落，集落之間分界明顯；圖 D 和圖 G 分別為 MDSC 單細胞克隆集落和亞克隆集落。圖 F，I 示 MDSC 克隆集落細胞多數(shù)呈小圓形，折光性強，少量呈短梭形，未出現(xiàn)向成熟肌細胞分化的狀態(tài)。(A，D，G；bar=200um；B，E，H；bar=100um；C，F(xiàn)，I；bar=50um.)圖 1-5 MDSC 單克隆細胞 Desmin/Sca-1 免疫組織化學染色。MDSC 單克隆細胞均呈現(xiàn) Desmin 染色陽性（綠色，圖 A），Sca-1 染色陽性（紅色，圖 B），Sca-1 陽性率為 92.3±4.1%；圖 C 示 Desmin/Sca-1共標。陰性對照組無陽性標記。(A，B，C； bar=33um)26
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

【共引文獻】

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本文編號：2514527