【摘要】：目的：用三種不同的方法提取B群腦膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡,分別為dOMV、nOMV、sOMV,并比較分析其免疫原性和毒性,為B群腦膜炎OMV疫苗的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：用超速離心的方法獲得三種OMV,通過(guò)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)分析其主要蛋白組分,Lowry法測(cè)定各種OMV的蛋白含量,LAL實(shí)驗(yàn)測(cè)定其內(nèi)毒素含量。免疫小鼠,通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠血清中的IgG含量,證實(shí)其免疫原性,殺菌力實(shí)驗(yàn)測(cè)試三種OMV誘導(dǎo)針對(duì)B群腦膜炎奈瑟氏菌補(bǔ)體依賴(lài)的殺菌反應(yīng)。結(jié)果：SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三種外膜的主要蛋白成分基本一致。LAL實(shí)驗(yàn)證實(shí)sOMV的內(nèi)毒素含量最多,其次為nOMV, dOMV含量最少。免疫小鼠后,ELISA和殺菌力實(shí)驗(yàn)證實(shí)nOMV的免疫效果最好,其次為dOMV, sOMV免疫效果較差。結(jié)論：用三種不同的方法成功制備了B群腦膜炎奈瑟氏菌的外膜囊泡(dOMV、nOMV、sOMV),從免疫原性、毒性等方面對(duì)三種外膜囊做了評(píng)價(jià)和比較,為制備B群腦膜炎OMV疫苗的相關(guān)研究做了鋪墊。 腦膜炎球菌天然外膜微泡(nOMV)包含完整的外膜,其中的外膜蛋白(OMP)和脂寡糖(LOS)處于自然構(gòu)象和天然外膜環(huán)境,有很好的免疫原性,但是其LOS毒性限制其應(yīng)用。基因1pxL2編碼與LOS脂質(zhì)A合成相關(guān)的酶,1pxL2基因敲除后可以降低LOS毒性,并且可能會(huì)提高疫苗對(duì)表面活性劑的敏感度。在本研究中,應(yīng)用基因敲除技術(shù)的方法和原理,通過(guò)PCR擴(kuò)增B群腦膜炎球菌1pxL2基因及載體pGBK T7上的Kan抗性片段,1pxL2片段與puc-18載體連接得到重組質(zhì)粒msb-puc,以重組質(zhì)粒msb-puc為基礎(chǔ),分別通過(guò)反向PCR和酶切兩種方法構(gòu)建1pxL2基因中間片段的缺失,并在缺失位點(diǎn)連入Kan抗性表達(dá)盒,從而得到重組質(zhì)粒mpK(impK), mpK(impK)轉(zhuǎn)化B群腦膜炎球菌,并用PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初步篩選鑒定,初步確定突變株一株。本研究通過(guò)基因敲除MenB中LOS合成途徑相關(guān)基因1pxL2的方法,降低LOS毒性,為B群腦膜炎球菌OMV疫苗的研發(fā)做了鋪墊。
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圖片說(shuō)明： 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士研究生畢業(yè)論文用去污劑處理的提取過(guò)程，PorA、PorB所占百分比較高(4.316%、2.216%);未經(jīng)去污劑處理的提取過(guò)程，OPaproteins所占百分比較高(noMV9.163%，soMV7.047%);三種不同的提取過(guò)程，RmpM所占百分比差異不大。2.OMV產(chǎn)率以總蛋白產(chǎn)率比推算OMV產(chǎn)率(圖1.2)。用去污劑處理所得的dOMV的產(chǎn)率最高(H.64)，未用去污劑處理，僅用EDTA刺激菌體釋放OMV的nOMV產(chǎn)率僅次于dOMV(10.21)，未用去污劑及ED工A所提取的s0MV的產(chǎn)率最低(4.135)。
文內(nèi)圖片：
圖片說(shuō)明： (1)以重組質(zhì)粒msb一puc為模板的反向PCR①反向PCR的引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)根據(jù)GenBallk核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中Nm基因組msbB序列，用Prime卜BLAST設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)如圖2.1所示。上下游引物引入酶切位點(diǎn)Bgln，序列如下:msbB一52:5”一GAAGAI，CTGAGGAACGCGTGCGCGAACAI，，一3’ Bgl11msbB一AZ:5”一GAAGAI，CTAAGCGCGTACACCGCCAI，CTC一3’ Bgl11
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2514435