發(fā)布時(shí)間：2019-01-26 21:57

【摘要】：胚胎學(xué)研究顯示,在魚類、鳥類、兩棲類、哺乳類等脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育早期共同具有一段形態(tài)上非常類似的時(shí)期,即種系特征發(fā)育(phylotypic)階段。科學(xué)家們普遍認(rèn)為,基因的表達(dá)調(diào)控決定著生物的性狀,追溯其外觀相似的生物本質(zhì),發(fā)現(xiàn)脊椎動(dòng)物胚胎早期發(fā)育相關(guān)的蛋白往往直系同源、其編碼蛋白的基因也具有較高的保守性,并且這些發(fā)育相關(guān)基因側(cè)翼的調(diào)控序列也高度保守�；趯�(duì)生物表型和本質(zhì)的認(rèn)識(shí),我們提出這樣一個(gè)設(shè)想,即脊椎動(dòng)物的早期發(fā)育(種系特征發(fā)育階段)模式受到了某種保守性的(表觀)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的控制。 我們將在生物演化中具有高度保守性的調(diào)控序列作為研究這一保守的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的切入點(diǎn)。超保守元件(UCE)在人類基因組中成簇分布,位于關(guān)鍵性發(fā)育基因的側(cè)翼,部分UCE已被驗(yàn)證在小鼠胚胎發(fā)育的特定組織中具有增強(qiáng)子活性。我們推測(cè),這些保守的調(diào)控元件因?yàn)楣δ苌系南嚓P(guān)性或者相似性而發(fā)生相互作用,形成保守的(表觀)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。加之對(duì)細(xì)胞核區(qū)隔化結(jié)構(gòu)及染色體空間結(jié)構(gòu)或位置對(duì)基因調(diào)控產(chǎn)生的影響等方面認(rèn)識(shí)的逐步深入,我們推測(cè),保守的(表觀)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的相關(guān)染色體很可能在細(xì)胞核空間發(fā)揮相互作用,并可能通過對(duì)染色體三維空間的相互作用進(jìn)行捕獲的方法將此網(wǎng)絡(luò)抽提出來。于是,本研究基于對(duì)細(xì)胞核染色體空間結(jié)構(gòu)的解析,挖掘并抽提這一保守的遺傳或表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò),以加深對(duì)基因調(diào)控和生物演化發(fā)育機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 人類胚胎干細(xì)胞由于其分化的多潛能性,成為研究人類胚胎發(fā)育的良好模型。近年來的研究發(fā)現(xiàn)了胚胎干細(xì)胞中具有的獨(dú)特基因表達(dá)模式:發(fā)育相關(guān)基因在胚胎干細(xì)胞中通常處于準(zhǔn)備(poised)的狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分化時(shí),特異基因可以迅速啟動(dòng)表達(dá),決定細(xì)胞向不同組織器官分化的命運(yùn)。同時(shí),人類胚胎干細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)了一類成年特異組織中不具備的增強(qiáng)子元件,即準(zhǔn)備型(poised)增強(qiáng)子元件(II類增強(qiáng)子),它們也與胚胎的早期發(fā)育密切相關(guān)�？梢�,胚胎干細(xì)胞中可能蘊(yùn)藏著生物早期胚胎的發(fā)育模式,這些特點(diǎn)為利用人類胚胎干細(xì)胞模擬人類胚胎發(fā)育的研究提供了依據(jù)。 SOX2是胚胎干細(xì)胞中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎干細(xì)胞多潛能性和未分化狀態(tài)維持中發(fā)揮著重要的功能。本研究從SOX2基因及其保守調(diào)控序列(SOX2 Bait)出發(fā),嘗試探討SOX2基因相關(guān)的染色體內(nèi)部相互作用及染色體之間的相互作用與人類胚胎干細(xì)胞多潛能性間的聯(lián)系,為尋找胚胎干細(xì)胞多潛能相關(guān)保守(表觀)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了線索。本研究從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了探討: 建立了穩(wěn)定的人類胚胎干細(xì)胞大量培養(yǎng)方法和體系,通過優(yōu)化培養(yǎng)條件及機(jī)械傳代和胰酶消化傳代相結(jié)合的方法,在較短時(shí)間內(nèi)獲得了質(zhì)量穩(wěn)定的足夠細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞材料;摸索了人類胚胎干細(xì)胞自主分化為EB細(xì)胞及定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞(NPC)的實(shí)驗(yàn)方法并獲得成功;關(guān)注人類胚胎干細(xì)胞向EB細(xì)胞分化過程中多潛能及分化相關(guān)基因的表達(dá)情況變化,發(fā)現(xiàn)了人類胚胎干細(xì)胞系H9在體外培養(yǎng)中的細(xì)胞異質(zhì)性現(xiàn)象。 利用4C方法在全基因組范圍內(nèi)篩選與SOX2 Bait相互作用的染色體片段。首先,通過體外構(gòu)建質(zhì)粒(pDNA)、模擬4C樣品的方法建立了4C-克隆篩選方法的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。針對(duì)以SOX2 Bait為誘餌片段的4C擴(kuò)增體系進(jìn)行了PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化,初步驗(yàn)證了該方法的有效性和可行性,為4C-有限克隆篩選和4C-seq樣品的制備提供了質(zhì)量保證。 利用4C-有限克隆篩選方法對(duì)人類胚胎干細(xì)胞4C樣品(4C-DpnII)進(jìn)行擴(kuò)增和初步篩選,得到了SOX2基因座位內(nèi)部的染色體相互作用片段。進(jìn)一步利用3C方法檢測(cè)了這些相互作用片段在人類胚胎干細(xì)胞向EB細(xì)胞分化過程中相互作用頻率的改變,構(gòu)建了SOX2基因局部染色體的三維構(gòu)象變化模型,推測(cè)染色體空間結(jié)構(gòu)改變與SOX2基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),已報(bào)道增強(qiáng)子SRR1、SRR2與啟動(dòng)子的相互作用隨著基因表達(dá)調(diào)控的改變而變化,這兩個(gè)增強(qiáng)子元件調(diào)控SOX2基因啟動(dòng)子的模式在hESC和EB兩種不同類型細(xì)胞中具有顯著差異。Region011區(qū)域在EB3d和EB20d細(xì)胞中被檢測(cè)到與啟動(dòng)子區(qū)具有相互作用,并在293A細(xì)胞中用熒光素酶報(bào)告基因的方法驗(yàn)證了該區(qū)域的增強(qiáng)子活性,提示Region011有可能成為潛在的增強(qiáng)子元件,調(diào)控SOX2基因在分化的EB細(xì)胞中表達(dá)。 接著,利用4C-seq技術(shù)對(duì)以SOX2 Bait為誘餌片段的4C樣品(4C-DpnII)單輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(4C-Seq樣品)進(jìn)行了Solexa高通量測(cè)序。篩選測(cè)序結(jié)果,將有效序列與人類基因組序列進(jìn)行比對(duì)后,共得到135個(gè)位于不同基因組位置的命中序列(或命中片段)。這些命中序列分布于基因組中絕大多數(shù)染色體上,約有四分之一具有較好的保守性,同時(shí)具有p300和Elk-1的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn),具有成為潛在增強(qiáng)子序列的可能。通過對(duì)命中序列相關(guān)基因功能的聚類分析(GO注釋),我們發(fā)現(xiàn)部分序列相關(guān)基因的功能與膜受體蛋白激酶活性、黃素單氧化酶活性、鈣離子結(jié)合等相關(guān),在細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)等生物學(xué)過程中有一定的富集。并且,一些基因還參與了肺及生殖器發(fā)育等生物學(xué)過程,可能與SOX2在肺癌、卵巢癌和乳腺癌中的重要功能有一定關(guān)聯(lián)。其中16個(gè)基因與鈣離子的結(jié)合功能相關(guān),與報(bào)道的SOX2在前列腺癌中的致瘤和抗凋亡機(jī)制似乎也存在某種聯(lián)系�？梢�,與SOX2 Bait相互作用的染色體片段在功能上可能與SOX2存在某種潛在聯(lián)系,通過對(duì)這些相互作用的檢測(cè)和功能分析,為抽提人類胚胎干細(xì)胞中SOX2基因相關(guān)保守(表觀)遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建了初步的框架。 利用3D-FISH實(shí)驗(yàn)從單細(xì)胞水平上檢測(cè)并驗(yàn)證染色體之間的相互作用。將改進(jìn)后的3D-FISH方法用于檢測(cè)兩個(gè)待測(cè)基因染色體間的相互距離分布,并與對(duì)照組的基因間距離分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,比較其顯著性差異,從而判定這兩個(gè)待測(cè)基因染色體在空間上是否相關(guān)。我們利用該方法在未分化的hESC和誘導(dǎo)分化的NPC兩種不同細(xì)胞類型中對(duì)4C-seq命中片段篩選到的4C-8/9(HMCN1基因內(nèi)含子區(qū))片段與SOX2 Bait(SOX2基因增強(qiáng)子)染色體間的相互作用進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證實(shí),HMCN1與SOX2的相互作用是hESC特異的,并且在hESC向NPC的分化過程中該相互作用消失。HMCN1和SOX2基因不僅在生物學(xué)功能上均與眼睛的發(fā)育相關(guān),而且通過對(duì)與SOX2 Bait發(fā)生相互作用的4C-8/9序列區(qū)域的組蛋白修飾情況的分析后發(fā)現(xiàn),4C-8/9區(qū)域具有HMCN1基因相關(guān)的潛在增強(qiáng)子的染色體修飾特點(diǎn),并且與SOX2基因增強(qiáng)子同屬于人類胚胎干細(xì)胞中的II類準(zhǔn)備(poised)型增強(qiáng)子,初步發(fā)現(xiàn)了人類胚胎干細(xì)胞中II類準(zhǔn)備(poised)型增強(qiáng)子所在染色體在細(xì)胞核空間共定位的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們,相互作用序列可能由于調(diào)控類型的相似性或者功能上的相關(guān)性而在細(xì)胞核空間相互靠近,為“功能相關(guān)或相近片段在細(xì)胞核空間相共定位”的實(shí)驗(yàn)假設(shè)提供了部分實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 最后,我們從機(jī)制和功能等方面進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞核中染色體片段空間共定位的現(xiàn)象進(jìn)行了深入的討論。利用3D-FISH方法,我們檢測(cè)了位于hESC核心調(diào)控通路中3個(gè)多潛能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、SOX2和Nanog)基因所在染色體的相對(duì)空間位置,發(fā)現(xiàn)Oct4和Nanog在空間上相互靠近;還檢測(cè)了4個(gè)同時(shí)具有9個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守序列片段的相對(duì)空間位置,發(fā)現(xiàn)R1和C4在細(xì)胞核中相互靠近。我們發(fā)現(xiàn)了處于同一調(diào)控通路的功能相關(guān)并相互協(xié)調(diào)基因間存在相互作用及調(diào)控機(jī)制相關(guān)的保守性序列也可能在空間上相互靠近,從染色體相互作用的生物學(xué)意義和機(jī)制等方面初步驗(yàn)證了“功能相關(guān)的保守序列在細(xì)胞核空間發(fā)生相互作用而形成網(wǎng)絡(luò)”的實(shí)驗(yàn)假設(shè)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 田靖;趙志虎;陳惠鵬;;人類基因組中的保守非編碼元件[J];遺傳;2009年11期

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本文編號(hào)：2415951