【摘要】：目的雌激素通過雌激素受體(Estrogen receptor, ER)介導(dǎo)參與骨代謝過程。自從雌激素受體β(Estrogen receptor beta, ERβ)被發(fā)現(xiàn)后,人們對雌激素的作用方式產(chǎn)生了全新的認識,這一發(fā)現(xiàn)為研究雌激素受體在骨代謝中作用機制開辟了新的途徑。此外,由成骨細胞與破骨細胞執(zhí)行的骨形成與骨吸收貫穿于骨代謝的全過程。而表達于成骨細胞表面的OPG/RANKL系統(tǒng)在闡明骨代謝發(fā)生機制方面具有重要意義,特別是OPG/RANKL比率的改變可以影響骨吸收和骨形成,從而影響骨代謝。本研究的主要目標包括：①構(gòu)建針對人ERβ基因逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)表達載體pRNAT-H1.4/Retro-shRNA并包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。②將其轉(zhuǎn)染人成骨樣細胞株MG63,觀察其對人成骨樣MG63細胞中ERp基因表達的影響。③構(gòu)建人成骨樣細胞ERβ基因敲低細胞模型并觀察在雌激素干預(yù)下ERp表達受抑后對人成骨樣MG63細胞株的OPG/RANKL比值的影響。為探討ERβ基因如何調(diào)節(jié)骨代謝提供新的理論基礎(chǔ)。 方法①根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的ERβ基因核苷酸序列,選擇設(shè)計3條針對人ERβ干擾靶序列,再轉(zhuǎn)化為能表達其小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(small hairpin RNAs, shRNA)的DNA序列,并與pRNAT-H1.4/ Retro質(zhì)粒定向連接,構(gòu)建真核表達載體pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA,經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切和DNA測序進行鑒定。將pRNAT-H1.4/ Retro-ERβ-shRNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293細胞包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。②對體外培養(yǎng)的MG63細胞進行形態(tài)學觀察及苔盤蘭-瑞氏染色。將包裝好的逆轉(zhuǎn)錄病毒,以空白及非特異性shRNA (shRNAnc)作為對照,感染人成骨樣MG63細胞株,用流式細胞儀檢測感染效率,然后各組于轉(zhuǎn)染48h后收集細胞分別抽提RNA及蛋白,半定量RT-PCR法檢測細胞中ERβmRNA表達水平的改變,Western blot法檢測ERp蛋白表達的變化,從而篩選最有效的干擾序列。③將含有最有效干擾序列及非特異性shRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒分別感染人成骨樣MG63細胞株后,篩選穩(wěn)定克隆并擴大培養(yǎng),以空白及非特異性shRNA作為對照,半定量RT-PCR法及Western blot法檢測穩(wěn)定抑制ERp的效率；MTT法測定RNAi干擾ERp后對人成骨樣MG63細胞增殖的影響；然后分別向三組細胞即MG63細胞、ERpshRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MG63細胞、陰性對照shRNAnc逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MG63細胞加入10-8mol/L的17β-雌二醇(E2)干預(yù),48h后收集細胞,分別抽提RNA及蛋白。應(yīng)用半定量RT-PCR法、Western blot法檢測人成骨樣細胞株MG63的OPG、RANKL mRNA和蛋白表達情況。用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析,計量資料統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,經(jīng)方差齊性檢驗,組間進行單因素方差分析(One way ANOVA)后,再用LSD法進行多個樣本均數(shù)間的顯著性檢驗,檢驗水準α=0.05。P值0.05表示顯著性差異。 結(jié)果①針對人ERβ分別構(gòu)建了3種shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA1, pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA2, pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA3。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定分析證實目的序列己插入到預(yù)計位點,符合設(shè)計要求,測序鑒定表明重組質(zhì)粒中含有針對ERp基因的目的序列,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。并經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至293細胞后成功包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒。②感染結(jié)果顯示,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能高效、穩(wěn)定的感染人成骨樣MG63細胞株,感染效率為70%左右。瞬轉(zhuǎn)的結(jié)果表明：3種shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對人成骨樣MG63細胞株的ERβmRNA抑制率分別為44.77±5.41%、61.21±4.47%、80.11±1.72%,蛋白抑制率分別為44.84±0.96%、62.52±1.02%、81.18±0.73%(均P0.05)。其中pRNAT-H 1.4/Retro-ERβ-shRNA3對人成骨樣MG63細胞株的ERp抑制效率最高。③用pRNAT-H1.4/Retro-ER(3-shRNA3進一步穩(wěn)轉(zhuǎn)人成骨樣MG63細胞株,與空白及陰性病毒對照組相比,篩選出ERβ表達穩(wěn)定抑制的人成骨樣細胞株,ERpmRNA抑制率為88.17±1.17%(P0.05),蛋白抑制率為89.01±1.22%(P0.05)。MTT法顯示RNAi干擾ERp后人成骨樣MG63細胞增殖未見明顯變化。雌激素干預(yù)48h后,顯示ERp穩(wěn)定抑制的MG63細胞較空白組及陰性對照組OPG mRNA上調(diào)15.51±1.72%,蛋白表達上調(diào)20.35±1.15%(P0.05),RANKL mRNA下調(diào)22.17±0.94%,蛋白表達下調(diào)27.22±1.48%(P0.05),OPG/RANKL表達上調(diào)(P0.05)。 結(jié)論①應(yīng)用pRNAT-H1.4/Retro載體成功構(gòu)建了3種pRNAT-H1.4/Retro-ERβ-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體并包裝成pRNAT-H1.4/Retro-ERp-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒。②包裝后的3種ERβ-shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒均能高效、穩(wěn)定的感染人成骨樣MG63細胞,并顯著抑制ERp的表達。其中以ERβ-shRNA3為最佳的干擾序列。③成功建立了人成骨樣細胞雌激素受體p亞型基因敲低細胞模型。并發(fā)現(xiàn)在雌激素干預(yù)下通過利用RNAi沉默ERp基因后可上調(diào)人成骨樣MG63細胞OPG mRNA和蛋白表達、下調(diào)RANKL mRNA和蛋白表達,上調(diào)OPG/RANKL表達,從而提示ERp可能通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL在骨代謝中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 姚靜;侯加法;;OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2006年02期

2 高坤;鎬英杰;張暉;裴福興;;靶向RANKL基因的siRNA對成骨細胞促破骨細胞生成作用的影響[J];四川醫(yī)學;2007年06期

3 劉繼中,紀宗玲,陳蘇民;OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)與骨破壞性疾病[J];生物工程學報;2003年06期

4 韓萍,張金萍;骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制和病因[J];現(xiàn)代康復(fù);2001年04期

5 郭葆玉;;RNA干擾技術(shù)[J];藥物生物技術(shù);2008年02期

6 吳潔;邱勇;張樂;孫燕芳;陳新;;青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者雌激素受體基因多態(tài)性與骨密度的關(guān)系[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2006年03期

7 劉臻;邱勇;孫強;吳潔;陳軍浩;陳蕾蕾;馬薇薇;;RANKL/OPG在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者低骨量發(fā)生機制中的作用[J];中國骨質(zhì)疏松雜志;2007年07期

8 孫旭;邱勇;;青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者骨密度的研究進展[J];中國脊柱脊髓雜志;2007年04期

9 殷剛;邱勇;黃愛兵;劉臻;李海波;孫光權(quán);曹興兵;;青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者成骨細胞中核因子κB受體活化子配體和骨保護蛋白的表達[J];中國脊柱脊髓雜志;2009年03期

，

本文編號：2415851