【摘要】：呼吸道病毒是引發(fā)嬰幼兒急性呼吸道感染疾病的主要病原體,目前仍有60%的小兒呼吸道疾病病理未闡明。2005年瑞典科學(xué)家Allander從患呼吸道疾病的嬰幼兒感染樣本中分離到一種新病毒,命名為人類博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。HBoV為單鏈、無包膜DNA病毒,屬于細(xì)小病毒科,博卡病毒屬。最近,在胃腸道疾病患者的糞便中又發(fā)現(xiàn)了三種不同基因型的人類博卡病毒HBoV2、HBoV3和HBoV4。目前,由于未分離得到HBoV病毒粒子,感染性克隆的構(gòu)建又受阻于難以獲得病毒基因組末端回文序列(ITR),因此,對人類博卡病毒的研究多局限于流行病學(xué)方面,而有關(guān)病毒致病機制的研究報道甚少。本實驗采集患有呼吸道疾病嬰幼兒痰液樣本,從中鑒定出人類博卡病毒(HBoV1),構(gòu)建病毒基因組中間大片段克隆(缺少ITR),并獲得包含HBoV1基因組的重組桿狀病毒。以構(gòu)建的克隆及重組桿狀病毒為工具,對該病毒的轉(zhuǎn)錄機制、蛋白表達(dá)、啟動子活性及病毒非結(jié)構(gòu)蛋白對該啟動子的調(diào)控作用進行分析。研究結(jié)果為深入揭示人類博卡病毒感染途徑和致病機理提供理論基礎(chǔ),將促進病毒性呼吸道感染的治療和預(yù)防。本論文的研究主要取得了以下幾個方面的進展： 采用PCR擴增方法,以人類博卡病毒的NP1基因作為目標(biāo)基因,對2007年10月-2009年3月收集的941例下呼吸道感染患者的痰液標(biāo)本進行檢測。941份標(biāo)本中共檢測到33份HBoV陽性擴增產(chǎn)物,陽性率為3.51%(33/941),且在所檢出的陽性樣品中,1歲以下嬰幼兒樣品共有24份,占陽性樣72.7%,表明人類博卡病毒的敏感人群為1周歲以下嬰幼兒。以檢測的陽性樣本DNA為模板,通過分子生物學(xué)方法,構(gòu)建了含有HBoV中間大片段基因組克隆,命名為WHL-1,基因組序列比對為HBoV1型,序列全長5299bp (GenBank Acession NO. GU139423)。運用BLAST分析該病毒株與GenBank中HBoV1基因的同源性,結(jié)果顯示W(wǎng)HL-1病毒株與目前報道的其他幾株人類博卡病毒有高度同源的基因組序列。目前為止還未得到病毒基因組的末端回文序列。 PCR擴增人類博卡病毒左端唯一啟動子區(qū),分別構(gòu)建病毒啟動子增強型綠色熒光蛋白(EGFP)/熒光素酶報告基因重組載體：pGL3-pBoV-EGFP/pGL3-Basic-pBoV,轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞,通過檢測綠色熒光蛋白表達(dá)和熒光素酶活性定性并定量研究人類博卡病毒啟動子在哺乳動物細(xì)胞中的活性。結(jié)果顯示,啟動子在試驗細(xì)胞中都具有活性,且比強啟動子巨細(xì)胞病毒啟動子(Cytomegalovirus,CMV)活性更高,在293T細(xì)胞中HBoV1啟動子活性是CMV的4-5倍。將252bp啟動子序列截短成7段,克隆到pGL3-Basic載體中,通過測定熒光素酶報告基因發(fā)光值檢測各片段的活性,我們發(fā)現(xiàn)1-95nt序列對啟動子活性無影響,而96-145nt區(qū)域?qū)幼踊钚杂泻艽笥绊?推測該區(qū)段為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。通過共轉(zhuǎn)染試驗,發(fā)現(xiàn)在被轉(zhuǎn)染的293T和HeLa細(xì)胞中,病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1對HBoV1啟動子具有反式激活作用,熒光素酶活性檢測實驗證實啟動子活性增強2-3倍,推測NS1蛋白在病毒轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用。 通過RT-PCR及RACE實驗,我們在pWHL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中檢測到NP1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。兩個轉(zhuǎn)錄子的起始位點都位于186nt處,在mRNA1中,只發(fā)生一次剪接(供體位點在241nt處,受體位點在2236nt處),在mRNA2中,發(fā)生兩次剪接(第一次位于241nt、2044nt處,第二次位于2164nt、2236nt處)：發(fā)現(xiàn)兩個不同的NP1mRNA多聚腺苷酸位點,分別位于3233nt和3389nt。Southern blot試驗顯示,pWHL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未發(fā)生病毒DNA復(fù)制,進一步證明ITR結(jié)構(gòu)對病毒DNA復(fù)制是必需的,且HBoVl啟動子為早期強啟動子。啟動子在試驗細(xì)胞中啟動病毒NP1基因轉(zhuǎn)錄并翻譯,產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白NP1定位在細(xì)胞核中。 利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了包含HBoVl中間大片段的重組桿狀病毒Bac-HBoVl及包含啟動子-EGFP片段的重組桿狀病毒Bac-Bov-EGFP。通過流式細(xì)胞儀統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的細(xì)胞,我們發(fā)現(xiàn)在試驗的多數(shù)哺乳動物細(xì)胞中,重組桿狀病毒Bac-Bov-EGFP的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比重組質(zhì)粒pGL-pboca-EGFP的轉(zhuǎn)染效率高,如相對轉(zhuǎn)染效率較低的A-549細(xì)胞,重組桿狀病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達(dá)到50%-60%。由于操作過程中不需要使用昂貴且對細(xì)胞有毒性的轉(zhuǎn)染試劑,又可通過昆蟲細(xì)胞擴增得到大量重組桿狀病毒粒子,該系統(tǒng)為轉(zhuǎn)染效率較低細(xì)胞接納外源基因提供更為優(yōu)化的平臺。同時,構(gòu)建的重組桿狀病毒Bac-HBoV1轉(zhuǎn)導(dǎo)293T、HeLa和A549細(xì)胞,都可檢測到HBoVl-NP1基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),與pWHL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的結(jié)果一致,進一步證明該系統(tǒng)的可行性及優(yōu)越性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R373;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2387043