【摘要】：人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)是導(dǎo)致先天性流產(chǎn)和新生兒智力低下的主要病毒病因,并且在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染者中引發(fā)嚴(yán)重和致死性的并發(fā)癥。為探討HCMV病毒感染和復(fù)制的分子機制,本文從3個方面對HCMV病毒的相互作用蛋白進行了系統(tǒng)篩選和功能研究,分別是:(1)運用酵母雙雜交技術(shù)系統(tǒng)篩選8個HCMV病毒DNA復(fù)制蛋白(UL44,UL54,UL57,UL70,UL84,UL102,UL105,UL114)的相互作用細(xì)胞蛋白,部分結(jié)果進一步進行免疫共沉淀驗證。由此發(fā)現(xiàn)了包括UBC9、SNAPAP、PIAS3、FHL2、DNAJB6、CTBP2、POLD2、ATRX、PFAAP5 和 ZMYND19 等在內(nèi)的 130 個能同上述病毒蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白和154個不同的相互作用關(guān)系。結(jié)合來源于文獻(xiàn)的數(shù)據(jù),該結(jié)果為全面了解涉及到HCMV病毒DNA復(fù)制的宿主-病毒蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)通路的復(fù)雜性提供了基礎(chǔ),同時也描繪出一個病毒蛋白"由基因至功能"的全過程草圖。(2)運用酵母交配技術(shù)系統(tǒng)篩選174個HCMV病毒蛋白同16個HIV病毒蛋白間可能的相互作用關(guān)系。由此發(fā)現(xiàn)了 7個HIV病毒蛋白同7個HCMV病毒蛋白間存在的 12 對相互作用,它們分別是 PR-RL1、Nef-RL1、p17-RL1、p24-RL1、Tat-RL1、p6-RL1、p6-UL119、p6-UL125、IN-RL7、IN-UL24、IN-UL45 和 IN-UL77。這些相互作用的發(fā)現(xiàn),為發(fā)展出控制HCMV-HIV病毒共感染、致病的策略和手段提供了一個全新的視角。(3)運用激光共聚集、His pull down和免疫共沉淀等實驗手段,從體外和體內(nèi)證實了 HCMV的ppUL44蛋白同細(xì)胞小泛素樣修飾E2結(jié)合酶UBC9的相互作用,確認(rèn)了 ppUL44的11-16位和260-269位的這兩段氨基酸短區(qū)域?qū)Y(jié)合至關(guān)重要。并進一步證實了 ppUL44是一個新發(fā)現(xiàn)的小泛素樣修飾蛋白(sumo)底物,sumo-1、-2、-3蛋白均可以共價結(jié)合到病毒蛋白上,ppUL44位于ψKxE保守序列中的410位賴氨酸是ppUL44主要的小泛素樣修飾位點。這些結(jié)果證明了 UBC9蛋白同ppUL44的結(jié)合、及小泛素樣修飾在調(diào)節(jié)ppUL44的功能和HCMV病毒的復(fù)制方面的重要作用。上述3個方面的研究,將有利于闡明病毒基因在致病和復(fù)制中的功能,進而深入理解巨細(xì)胞病毒的感染機制。
[Abstract]:Human cytomegalovirus (human cytomegalovirus,HCMV) is the main cause of congenital abortion and neonatal mental retardation, and it can cause severe and fatal complications in (human immunodeficiency virus,HIV infection. In order to investigate the molecular mechanism of HCMV infection and replication, the interaction proteins of HCMV virus were systematically screened and their functions were studied from three aspects. The results were as follows: (1) eight interacting cellular proteins of DNA replication protein (UL44,UL54,UL57,UL70,UL84,UL102,UL105,UL114) of HCMV virus were screened by yeast two-hybrid technique, and some of the results were further verified by immunoprecipitation. A total of 130 cellular proteins, including UBC9,SNAPAP,PIAS3,FHL2,DNAJB6,CTBP2,POLD2,ATRX,PFAAP5 and ZMYND19, were found to interact with the virus proteins and 154 different interactions were found. Combined with data from the literature, the results provide the basis for a comprehensive understanding of the complexity of the host-virus protein interaction network pathway involved in the replication of HCMV virus DNA. At the same time, a whole process sketch of viral protein "from gene to function" was described. (2) the possible interaction between 174 HCMV proteins and 16 HIV virus proteins was screened by yeast mating technique. 12 pairs of interactions between 7 HIV virus proteins and 7 HCMV virus proteins were found. They are PR-RL1,Nef-RL1,p17-RL1,p24-RL1,Tat-RL1,p6-UL119,p6-UL125,IN-RL7,IN-UL24,IN-UL45 and IN-UL77.. The discovery of these interactions provides a new perspective for the development of strategies and means to control co-infection and pathogenesis of HCMV-HIV virus. (3) Experimental methods such as laser co-aggregation of, His pull down and immunoprecipitation are used. In vitro and in vivo, the interaction of HCMV ppUL44 protein with small ubiquitin modified E2 binding enzyme (UBC9) was confirmed. The short amino acid regions at the 11-16 and 260-269 positions of ppUL44 were confirmed to be crucial for the binding. It is further confirmed that ppUL44 is a newly discovered (sumo) substrate of a small ubiquitin like modified protein, and sumo-1,-2,-3 protein can be covalently bound to the viral protein. Lysine at the 410th position in the conserved sequence of ppUL44 in 蠄 KxE is the main small ubiquitin like modified site of ppUL44. These results indicate that the binding of UBC9 protein to ppUL44, and the role of ubiquitin like modification in regulating the function of ppUL44 and the replication of HCMV virus. The above three studies will be helpful to clarify the function of viral gene in pathogenesis and replication, and to further understand the mechanism of cytomegalovirus infection.
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R373

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本文編號：2293738