本文選題：肉毒毒素 + 單克隆抗體��； 參考：《上海交通大學》2012年博士論文

【摘要】：肉毒毒素(botulinumtoxins,BoNTs)是肉毒梭狀芽孢桿菌在厭氧條件下產(chǎn)生的一組外毒素蛋白,它可導致神經(jīng)中毒癥狀,是目前已知的自然界中最毒的物質(zhì)。BoNTs有七種血清型(A-G),各型均為雙鏈蛋白分子(分子量150KD),由重鏈(HC-100KD)和輕鏈(LC-50KD)通過二硫鍵連接。輕鏈是催化功能結(jié)構(gòu)域具有內(nèi)肽酶的活性。重鏈由兩個結(jié)構(gòu)域組成;與膜轉(zhuǎn)位相關的N端結(jié)構(gòu)域(HN)和與神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)相關的C端結(jié)合域(Hc)。研究表明,BoNT/Hc包含保護性抗原基本決定簇作為免疫原能引發(fā)顯著的保護性應答。肉毒毒素通過作用于神經(jīng)細胞,抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,引起松弛性神經(jīng)麻痹,肉毒中毒是一種致死率很高的疾病,自然狀況下,A、B、E、F型肉毒毒素是引起人類中毒的主要類型。使用中和保護性抗血清治療是目前治療肉毒毒素中毒的最有效的手段。目前尚無能夠有效保護BoNTs的中和保護性單克隆抗體用于臨床治療。因此研究抗BoNTs的中和保護性單克隆抗體及其識別表位和作用機制,對研制預防性疫苗、制備治療性抗體具有重要意義。本論文旨在利用雜交瘤技術篩選獲得具有中和活性的單克隆抗體。鑒定抗體的體內(nèi)、外中和保護活性,通過噬菌體展示技術,淘選抗體識別的中和表位,進而分析BoNT/Hc結(jié)構(gòu)上的功能結(jié)構(gòu)域與抗體結(jié)合表位的關系。初步闡明抗體中和保護作用的機制,為治療性肉毒毒素抗體的研發(fā)提理論基礎和實驗依據(jù)。研究主要包括以下幾個部分:一、BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc的表達和純化我們分別全基因合成了BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc DNA序列,并構(gòu)建了大腸桿菌原核表達載體。成功地可溶性表達了BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc蛋白,并WB驗證之。二、抗BoNTs單克隆抗體的篩選、鑒定和制備我們以表達純化的bont/bhc蛋白作為免疫原,采用常規(guī)的雜交瘤技術制備了分泌結(jié)合bont/bhc抗體的16株雜交瘤細胞株,經(jīng)初步篩選和鑒定獲得3株結(jié)合在bont/bhc不同功能區(qū)域且具中和保護活性的抗體(2f4、5g10、8e10、),其中8e10抗體具有型交叉結(jié)合活性。并對它們亞型及親和力進行了測定。三、3株抗體體內(nèi)中和保護活性檢測采用經(jīng)典的小鼠體內(nèi)攻毒保護實驗,檢測了3株抗體的bont/b中和保護活性,抗體中和保護活性的檢測結(jié)果表明,3株抗體都能完全中和保護10倍ld50sbont/b的攻擊,40倍ld50bont/b的攻毒擊時,2f4和5g10抗體能完全保護小鼠,無一死亡;8e10抗體也能延長小鼠生存時間達72h左右。而且8e10對bont/a、bont/e、bont/f還有較強的交叉中和保護活性。四、抗體表位的淘選、鑒定及其保護機制的研究為了分析2f4、5g10和8e10抗體所識別的中和表位,首先采用噬菌體隨機12肽庫對這三株抗體所識別的表位分別進行淘選,獲得它們識別的表位序列。然后,通過合成表位肽的競爭性elisa實驗鑒定抗體識別表位。序列比對結(jié)果表明:3株抗體所識別的表位序列均位于bont/bhc的受體結(jié)合區(qū)域:2f4識別表位1114kxsp1117和5g10識別的表位1201sdxfy1205均與bont/bhc的蛋白受體結(jié)合域部分重疊,但兩表位完全不重疊;8e10所識別的表位1259sxwy1262位于bonts保守的gt1b受體結(jié)合域(h…sxwy…g)內(nèi)。wb和elisa實驗結(jié)果也證實8e10交叉結(jié)合四種毒素hc蛋白。五、不同識別表位的抗體間的協(xié)同作用及其機制研究為了研究這三株識別的表位不重疊的抗體是否具有保護協(xié)同作用,我們分別檢測單株抗體和不同株抗體間組合的體內(nèi)中和保護效果,對比發(fā)現(xiàn)結(jié)合在gt1b受體結(jié)合位點上的8e10抗體,與分別結(jié)合sytii的結(jié)合位點上不重疊抗原表位的抗體5g10或2f4組合有協(xié)同作用,然而,盡管5g10和2f4分別結(jié)合sytii結(jié)合的區(qū)域不重疊的位點,但兩者組合沒有協(xié)同作用。8e10的結(jié)合表位在bont/a,b,e和f中是高度保守的。它可以交叉保護不同血清型的bonts攻擊。因此,這株抗體有望成為一個與結(jié)合在其他毒素功能結(jié)構(gòu)域的抗體一起有協(xié)同保護作用的通用的伙伴抗體�？傊�,本研究經(jīng)篩選、鑒定獲得了3株具有中和保護活性的單克隆抗體(8E10、5G10、2F4),采用噬菌體隨機12肽庫對這三株抗體所識別的抗原表位進行淘選,獲得其識別的表位序列。研究了具有中和保護活性的抗體識別的表位及其機制,并探討了8E10抗體的交叉保護機制,揭示了識別不同表位的抗體的協(xié)同效應機制。為肉毒中毒的預防和治療性抗體的研制及應用提供了理論基礎和設計依據(jù)。
[Abstract]:BoNT / Hc , BoNT / BHc , BoNT / EHc , BoNT / EHc and BoNT / FHC have been successfully used in the study of anti - BoNT / Hc , BoNT / BHc , BoNT / EHc and BoNT / FHC . in ord to study that protective effect of monoclonal antibodies ( 8E10 , 5G10 , 2F4 ) which bind to the binding sites of the other toxin , it was found that the monoclonal antibodies ( 8E10 , 5G10 , 2F4 ) which bind to the binding sites of the other toxin were highly conserved .
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【共引文獻】

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本文編號：2074886