本文選題：軟骨細胞 + 骨髓間充質(zhì)干細胞　； 參考：《山東大學(xué)》2011年碩士論文

【摘要】：目的 軟骨組織損傷是近年來常見的疾病,創(chuàng)傷及非創(chuàng)傷性的病理損傷為其常見病因,由于軟骨結(jié)構(gòu)由Ⅱ型膠原相互交織形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及包埋其中的蛋白多糖及軟骨細胞所構(gòu)成,而且軟骨組織內(nèi)沒有血管及軟骨細胞的增生及遷移能力有限,因此軟骨損傷后的軟骨自身修復(fù)能力差。目前臨床上沒有較好的方法來治療軟骨缺損,近年來利用組織工程學(xué)方法治療軟骨缺損成為研究的熱點之一。而組織工程學(xué)所應(yīng)用的種子細胞主要包括成體干細胞及自體軟骨細胞。自體軟骨細胞由于存在細胞數(shù)目少、移植后遠期效果不佳以及供區(qū)可發(fā)生并發(fā)癥等問題,而影響了其在臨床的應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell s, bMSCs)是骨髓中除了造血干細胞之外的另一類成體干細胞,具有多向分化潛能,在不同的條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞及神經(jīng)細胞,但目前由于沒有特異性的表型,其鑒定尚無統(tǒng)一標準,大多數(shù)鑒定依賴于其形態(tài)水平、功能特征及培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型來協(xié)助鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞。由此成功分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞,并誘導(dǎo)分化為成軟骨細胞,對治療軟骨損傷具有重要意義。本實驗采用體外培養(yǎng)擴增、鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細胞,利用其分化潛能,觀察其誘導(dǎo)分化為成軟骨細胞的可行性。 方法 1. BMSCs的分離純化與培養(yǎng)：取3月齡健康新西蘭大耳白兔6只,行雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)平臺穿刺抽取骨髓5 mL,以1.073g/ml密度Percoll分離液結(jié)合密度梯度離心法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell s, bMSCs),懸浮于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/mL,鏈霉素100 U/mL),輕輕吹打均勻,接種到25 cm2培養(yǎng)瓶,置37℃,體積分數(shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),按1：2比例傳代培養(yǎng)。 2. BMSCs生長曲線的測定：取第3代生長良好的細胞,用0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液,以每孔細胞濃度為1×108L-1分別接種于24孔板中的各孔,每孔1 mL,置于37℃、體積分數(shù)為5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第2天起每日取3孔,去除培養(yǎng)液,胰酶消化后制備成細胞懸液,以細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù),計算平均值,以細胞數(shù)為縱坐標,時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。 3. BMSCs的細胞表面標志鑒定：細胞生長接近融合時,取第5代生長良好的細胞,用0.25%胰蛋白酶消化后,用PBS緩沖液沖洗2遍,并制備成(5~10)×108L-1濃度的細胞懸液,取0.1 mL細胞懸液置于不同離心管中,各個離心管中分別加入CD29、CD44、CD45的一抗,37℃孵箱孵育20 min后,以PBS緩沖液沖洗2遍后,加入二抗37℃孵箱孵育20 min,沖洗后重懸細胞于0.5 mL PBS緩沖液中為流式細胞分析用。 4. BMSCs向成軟骨細胞的誘導(dǎo)：取第3代生長良好的兔BMSCs,以1×108L-1的細胞濃度接種于內(nèi)含蓋玻片的12孔培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)24 h后,待細胞完全貼壁,將細胞設(shè)為對照組和誘導(dǎo)組,對照組繼續(xù)以含體積分數(shù)為10%胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng),誘導(dǎo)組換成含成軟骨誘導(dǎo)劑的H-DMEM培養(yǎng)液(含TGF-1 10μg/L、IGF-Ⅰ110μg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.25 mg/L、地塞米松10 mmol/L、維生素C 0.05mmol/L),每2 d或3 d換液1次,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。誘導(dǎo)21 d后免疫細胞化學(xué)染色,觀察細胞Ⅱ型膠原表達情況。 結(jié)果 1.細胞形態(tài)學(xué)觀察原代細胞2 d或3 d首次換液后,可見少量單個核細胞貼壁生長,多為短柱性或多角形。4 d或5 d全量換液,去除大量漂浮的細胞,可見分散的BMSCs小集落,細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形,胞核為圓形或橢圓形,胞漿內(nèi)可見較多的顆粒。6～9 d時細胞迅速生長,小集落逐漸融合成大集落,可呈輻射狀生長,10～14 d細胞大部分融合,達90%以上,細胞形態(tài)均勻,長梭形,排列緊密,呈旋渦狀或菊花狀。傳代培養(yǎng)后,細胞形態(tài)更為均一,排列更加整齊,增殖速度明顯加快,6～8 d細胞可融合達90%以上,可再行傳代。 2. BMSCs生長曲線細胞生長2 d內(nèi)處于潛伏期,生長緩慢,3～5 d進入對數(shù)增長期,呈對數(shù)增長,6～8 d處于平臺期,細胞鋪滿瓶底,增殖緩慢。3.流式細胞結(jié)果分析 3.1原代細胞流式細胞分析結(jié)果：原代細胞有62.4%的細胞表達CD29,有60.3%的細胞表達CD44,有2.79%的細胞表達CD45。 3.2傳代細胞的流式細胞分析：第3代有99.9%的細胞表達CD29,有99.6%的細胞表達CD44,有2.62%的細胞表達CD45。 4.Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色BMSCs誘導(dǎo)21 d后可見Ⅱ型膠原陽性細胞較多,陽性位置位于胞漿內(nèi),呈棕黃色至棕褐色細密顆粒,在胞核周圍更加明顯。平行培養(yǎng)未誘導(dǎo)的BMSCs棕黃色顆粒不明顯,著色較淺,陽性細胞數(shù)目較少。 結(jié)論 1.本實驗首次通過流式細胞術(shù)顯示原代細胞與第3代細胞各因子表達情況不同,原因可能是原代細胞通過密度梯度離心法分離后,仍有部分其他細胞伴隨培養(yǎng),隨著細胞的擴增傳代,雜細胞逐漸減少,BMSCs的純度越來越高,第3代細胞高度表達CD29、CD44而不表達CD45,表明所培養(yǎng)的BMSCs是單一的細胞群,不含造血細胞等其他細胞,其純度較高。 2.本實驗研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞在含TGF-β1和IGF-Ⅰ的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)后體外擴增能力明顯降低,誘導(dǎo)21 d后形態(tài)變化比較顯著,Ⅱ型膠原免疫組化染色明顯。 3.本實驗應(yīng)用密度梯度離心法可成功分離并擴增骨髓間充質(zhì)干細胞,第3代細胞純度較高,在適當?shù)臈l件下,具有分化為成軟骨細胞的潛能。
[Abstract]:Purpose

In recent years , bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) can be differentiated into osteoblast , chondrocytes , fat cells , myoblasts and nerve cells .

method

1 . Bone marrow mesenchymal stem cells ( bMSCs ) were isolated and purified from 6 rabbits with 3 - month - old healthy New Zealand white rabbits . Bone marrow mesenchymal stem cells ( bMSCs ) were isolated and purified by density gradient centrifugation .

2 . The growth curve of the cells was measured by using 0.25 % trypsin to prepare the cell suspension . The cells were incubated in a 24 - well plate with a concentration of 1 脳 108 L - 1 at 37 鈩，

本文編號：1892411