本文選題：細小病毒B19 + VP1u�。� 參考：《華中師范大學》2012年碩士論文

【摘要】：人細小病毒B19于1975年被Yvonne Cossart首次發(fā)現,是感染人的細小病毒之一,且能潛在抑制紅細胞的生成,能引起多種疾病。B19感染具有特異性,其傾向于感染表面具有紅細胞糖苷酯受體的原紅細胞。B19侵入細胞除需要紅細胞糖苷酯受體外還需要輔助受體a5β1整聯蛋白以及具有活性的自主抗原KU80。不同年齡段的宿主感染B19則表現為不同的臨床癥狀,比如在成年人中,關節(jié)炎、關節(jié)痛以及發(fā)熱癥狀發(fā)生頻率比較高；而在兒童中,貧血癥發(fā)生頻率相對較高。B19的衣殼由結構蛋白VP1和VP2構成,除了VP1的N端有額外的227個氨基酸序列外,VP1和VP2其它氨基酸序列相同。研究發(fā)現,VP1特有的227個氨基酸具有磷脂酶A2活性,其中第130-195位氨基酸為酶活性的保守區(qū)域,該保守區(qū)外的氨基酸可能對于形成蛋白質正確的三維結構以保持酶的穩(wěn)定及作用底物與酶的中心充分接近非常重要。 B19-VP1U在病毒的生活周期中具有重要的功能,尤其磷脂酶A2活性對病毒的感染是必須的,若病毒缺乏VP1完整序列則病毒不具有感染性并且不能從細胞核轉運到細胞質,因此,B19-VP1U的磷脂酶A2活性在病毒的致病性、誘導自主免疫反應及炎癥的發(fā)生具有重要的作用。若把B19-VP1U磷脂酶A2活性部位的關鍵氨基酸進行突變則會導致酶活的下降或喪失,本實驗主要研究保守區(qū)外氨基酸對酶活性的影響。具體方案如下： (1)根據查閱的相關文獻從VP1u保守區(qū)外氨基酸的N端每隔10個或30個氨基酸進行截短突變,將截短突變的基因片段克隆到載體pMAL-c2x上,構建正確的重組載體。小規(guī)模誘導目的蛋白的表達,SDS-PAGE及Western-blot檢測目的蛋白后,大規(guī)模誘導,然后利用Amylose樹脂對目的蛋白進行純化。 (2)根據相關文獻及對VP1u相關序列的分析,從VP1u保守區(qū)外氨基酸的C端每隔7個或8個氨基酸進行截短突變,將截短突變的基因片段克隆到載體pMAL-c2x上,經測序得正確的重組質粒。目的蛋白經小規(guī)模誘導后,SDS-PAGE及Western-blot檢測,然后進行大規(guī)模誘導,利用Amylose樹脂對目的蛋白進行純化。 (3)獲得目的蛋白后,用Broadford試劑盒測定目的蛋白的濃度,保證蛋白濃度在0.5mg/ml以上,然后采用相應的試劑盒測其酶活,最后分析實驗結果。 通過測定磷脂酶A2的活性,結果發(fā)現當從N端截短12個AA時測的酶的活性值與完整VP1u相比降低了約35%,但截短67個AA時酶的活性就明顯下降了,當截短96個AA時酶的活性幾乎喪失,因此推測N端第1-96個AA之間的區(qū)域對酶的活性有顯著的影響；C端截短7個AA時對酶的活性沒有顯著影響幾乎與VPlu相同,但截短16個AA時酶的活性就顯著下降了,當截短24個AA時酶的活性幾乎喪失,因此推測C端第7-24個AA之間的區(qū)域對酶的活性有顯著影響。推測,對保守區(qū)外氨基酸截短突變而造成的磷脂酶A2活性的改變可能與B19-VP1U蛋白的正確的三維構象有很大的關系,因為蛋白質要保持活性必須具有完整的三維結構。這些結果將為進一步研究和解釋B19感染的分子生物學機制提供了一定的理論基礎。
[Abstract]:Human parvovirus B19 was first discovered by Yvonne Cossart in 1975. It is one of the parvovirus infected people and can potentially inhibit the formation of red blood cells. It can cause a variety of disease.B19 infection to be specific. It tends to infection of erythrocyte.B19 invading cells with red cell glycosidic ester receptor on the surface in addition to the need of erythrocyte glycosidic ester in vitro The host infection of the A5 beta 1 integrin and the active independent antigen KU80. for different ages of the host infected B19 showed different clinical symptoms, such as in adults, arthritis, joint pain, and fever, and in children, a relatively high frequency of.B19's capsid in children had a relatively high frequency. Protein VP1 and VP2 constitute the same sequence of other amino acids in VP1 and VP2 in addition to the additional 227 amino acid sequences at the N end of VP1. The study found that the 227 amino acids specific to VP1 have the activity of phospholipase A2, and the 130-195 amino acid is the conservative region of the enzyme activity, and the amino acid outside the conservative region may be three correct for the formation of protein. It is very important to maintain the stability of the enzyme and to keep the substrate close to the center of the enzyme.
B19-VP1U plays an important role in the life cycle of the virus, especially the phospholipase A2 activity is necessary for the virus infection. If the virus lacks the complete sequence of VP1, the virus is not infective and can not be transported from the nucleus to the cytoplasm. Therefore, the phospholipase A2 activity of B19-VP1U is in the virulence of the virus, induces the autoimmune reaction and inflammation. The occurrence of the disease has an important role. If the key amino acid of the B19-VP1U phospholipase A2 active site is mutated, the enzyme activity will be reduced or lost. This experiment mainly studies the effect of the amino acid on the enzyme activity in the conservative region.
(1) according to the related literature, a short mutation was carried out from 10 or 30 amino acids from the N terminal of the VP1u conservative region. The truncated gene fragment was cloned to the carrier pMAL-c2x, and the correct recombinant vector was constructed. A small scale induced the expression of the target protein and the SDS-PAGE and Western-blot were used to detect the target protein on a large scale. The Amylose resin was used to purify the target protein.
(2) according to the related literature and the analysis of the VP1u related sequences, every 7 or 8 amino acids were truncated from the C terminal of the amino acids outside the conservative region of VP1u. The truncated gene fragment was cloned to the carrier pMAL-c2x, and the correct recombinant plasmid was sequenced. After the target protein was induced by the small norm, SDS-PAGE and Western-blot were detected and then entered. The target protein was purified by Amylose resin.
(3) after the target protein was obtained, the concentration of the target protein was measured by Broadford kit, the concentration of the protein was above 0.5mg/ml, and then the enzyme activity was measured with the corresponding kit. Finally, the experimental results were analyzed.
By measuring the activity of phospholipase A2, it was found that the activity of the enzyme was reduced by about 35% compared with the complete VP1u when the 12 AA was truncated from the N end, but the activity of the enzyme decreased obviously when the 67 AA was truncated, and the activity of the enzyme was almost lost when the 96 AA was truncated. Therefore, it was speculated that the region between the 1-96 AA of the N terminal had a significant effect on the activity of the enzyme. The activity of the enzyme had no significant effect on the activity of the enzyme at the 7 AA truncated C terminal, but the activity of the enzyme decreased significantly when the 16 AA was truncated and the activity of the enzyme was almost lost when the 24 AA was truncated. Therefore, it was speculated that the region between the 7-24 AA at the end of the C side had a significant effect on the activity of the enzyme. The changes in the activity of phospholipase A2 may have a great relationship with the correct three-dimensional conformation of the B19-VP1U protein, because the protein to maintain the activity must have a complete three-dimensional structure. These results will provide a certain theoretical basis for further research and interpretation of the molecular biological mechanism of B19 infection.

【學位授予單位】：華中師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R373

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本文編號：1800803