本文選題：自然殺傷細(xì)胞　切入點(diǎn)：穿孔素　出處：《華中科技大學(xué)》2011年博士論文

【摘要】：一、前言 自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK cell)是固有免疫系統(tǒng)的重要組分,其通過釋放胞毒效應(yīng)分子(穿孔素、顆粒酶等)而殺傷畸變的自身細(xì)胞及感染病原體的靶細(xì)胞。NK細(xì)胞無需致敏即能直接殺傷靶細(xì)胞,并可連續(xù)殺傷多個靶細(xì)胞。目前尚不清楚,NK細(xì)胞每次殺傷過程中所釋放胞毒效應(yīng)分子的量,及其連續(xù)殺傷過程中通過何種機(jī)制不斷補(bǔ)充自身“彈藥庫”以維持“戰(zhàn)斗力”。理論上,NK細(xì)胞可不斷合成新的效應(yīng)分子,但該過程涉及效應(yīng)分子的糖基化修飾、剪切、構(gòu)象改變,最后進(jìn)入分泌性溶酶體,全程需數(shù)小時。因此,探討NK細(xì)胞持續(xù)性殺傷過程中合成和儲備胞毒效應(yīng)分子的確切機(jī)制,有助于從新的角度闡明NK細(xì)胞殺傷功能的機(jī)制。 免疫突觸與神經(jīng)突觸有諸多相似之處。文獻(xiàn)報道,神經(jīng)突觸胞吐后可發(fā)生有效的補(bǔ)償性內(nèi)吞,此對于維持突觸功能具有重要意義。神經(jīng)突觸內(nèi)分泌性囊泡與細(xì)胞膜融合后,包括膜蛋白的多種分子可迅速回收至神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),其生物學(xué)意義為：減少胞吐所致細(xì)胞膜表面積增大；回收的膜蛋白可參與形成新的分泌囊泡,從而有利于神經(jīng)突觸適應(yīng)不斷發(fā)放的神經(jīng)沖動。除膜蛋白外,神經(jīng)細(xì)胞還可回收可溶性神經(jīng)遞質(zhì)。近年文獻(xiàn)(包括本課題組前期研究)報道,免疫突觸中存在雙向運(yùn)輸?shù)妮d體,也具有回收存儲胞毒效應(yīng)分子的分泌性溶酶體膜蛋白的能力。深入探討胞毒效應(yīng)分子的回收作用,有助于揭示細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和NK細(xì)胞持續(xù)性殺傷作用的機(jī)制。 穿孔素是一類重要的胞毒效應(yīng)分子,在NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用,本文擬在課題組前期研究基礎(chǔ)上,探討NK細(xì)胞回收穿孔素的作用,并闡明其機(jī)制及生物學(xué)意義。 早期內(nèi)體是細(xì)胞回收細(xì)胞外物質(zhì)的最初細(xì)胞器,早期內(nèi)體體積增大提示外源性物質(zhì)的進(jìn)入。本實(shí)驗(yàn)用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白作為示蹤分子,觀察其被NK92細(xì)胞內(nèi)吞后的定位。轉(zhuǎn)鐵蛋白內(nèi)吞后進(jìn)入早期內(nèi)體,導(dǎo)致后者體積顯著增大,可作為細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞的指標(biāo)。此外,與早期內(nèi)體共定位也表明內(nèi)吞的分子已進(jìn)入早期內(nèi)體。 通過觀察NK92細(xì)胞早期內(nèi)體,判斷NK92細(xì)胞被靶細(xì)胞刺激后是否發(fā)生胞吞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NK92細(xì)胞受靶細(xì)胞刺激15分鐘后,其早期內(nèi)體比對照組明顯增大,提示NK92細(xì)胞發(fā)生內(nèi)吞。 乙二醇四醋酸[Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid, EGTA]可抑制NK92細(xì)胞胞吐,但并不影響NK92細(xì)胞與靶細(xì)胞間形成免疫突觸。為探討內(nèi)吞發(fā)生的時相,我們在NK92細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸過程中加入EGTA,發(fā)現(xiàn)可顯著抑制早期內(nèi)體增大。提示NK細(xì)胞內(nèi)吞繼發(fā)性于胞吐之后。 我們還發(fā)現(xiàn),靶細(xì)胞刺激NK92細(xì)胞15分鐘,穿孔素與早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象,而未受刺激的NK92細(xì)胞無此現(xiàn)象。另外,加入EGTA同樣可抑制穿孔素與早期內(nèi)體共定位。上述結(jié)果表明,NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞過程中出現(xiàn)穿孔素內(nèi)吞,該效應(yīng)繼發(fā)于胞吐。 首先應(yīng)用放線菌酮抑制新蛋白質(zhì)合成,以避免新生成的穿孔素干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。繼而應(yīng)用針對不同胞吞途徑的抑制劑,探討NK92細(xì)胞內(nèi)吞作用的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用針對clathrin途徑的抑制劑后,受靶細(xì)胞刺激的NK92細(xì)胞內(nèi)其穿孔素水平明顯降低(與未用抑制劑的NK92細(xì)胞相比)；應(yīng)用針對脂筏和胞飲途徑的抑制劑并不影響胞內(nèi)穿孔素水平。提示：穿孔素內(nèi)吞效應(yīng)為clathrin途徑依賴性,脂筏和胞飲途徑介導(dǎo)的內(nèi)吞不參與穿孔素回收。 借助共聚焦顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)穿孔素循clathrin內(nèi)吞途徑被回收,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在針對clathrin內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑作用下,NK92細(xì)胞受靶細(xì)胞刺激后,穿孔素和早期內(nèi)體無共定位。另外,應(yīng)用更具特異性的小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)證實(shí)穿孔素回收途徑：用針對clathrin重鏈(clathrin heavy chain,CHC)的siRNA干擾NK92細(xì)胞clathrin表達(dá),48小時后,靶細(xì)胞刺激并不導(dǎo)致穿孔素和早期內(nèi)體共定位；而用針對無關(guān)序列的siRNA干擾NK92細(xì)胞48小時,受靶細(xì)胞刺激后,穿孔素和早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位。由此證實(shí),穿孔素可以由clathrin內(nèi)吞途徑介導(dǎo)進(jìn)入早期內(nèi)體。 用針對clathrin內(nèi)吞途徑的抑制劑阻斷穿孔素回收,檢測對NK92細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞功能的影響：效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例為5：1和10：1,檢測NK92細(xì)胞對原代豬內(nèi)皮細(xì)胞(Primary porcine endothelial cells,PEC)和人紅白血病細(xì)胞株(Humanerythroleukemia cell line,K562)的殺傷率；應(yīng)用clathrin內(nèi)吞途徑抑制劑,NK92細(xì)胞對靶細(xì)胞殺傷率明顯低于對照組；用針對CHC的siRNA干擾NK92細(xì)胞(48h),導(dǎo)致后者對靶細(xì)胞殺傷率明顯降低(用針對無關(guān)序列的siRNA干擾作為對照)。 為探討clathrin途徑依賴的胞吞在NK92細(xì)胞持續(xù)性殺傷靶細(xì)胞中的作用,將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例設(shè)為1：2和1：5,檢測不同時間點(diǎn)NK92細(xì)胞對靶細(xì)胞(PEC和K562)的殺傷率。與上述結(jié)果相印證,在效靶細(xì)胞比例倒置的情況下,NK92細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率隨殺傷時間延長而逐步增高；抑制clathrin途徑的內(nèi)吞(化學(xué)抑制劑和siRNA)后,NK92細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率低于對照(未抑制clathrin途徑)。 為觀察原代NK細(xì)胞是否也存在類似現(xiàn)象,用磁珠分離新鮮人外周血NK細(xì)胞(純度95%),用靶細(xì)胞刺激NK細(xì)胞15分鐘,穿孔素與早期內(nèi)體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象,而靜息狀態(tài)下不發(fā)生此現(xiàn)象。同時,抑制clathrin介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑,則NK細(xì)胞的殺傷功能降低。 上述結(jié)果表明,clathrin途徑介導(dǎo)的內(nèi)吞在NK細(xì)胞殺傷功能中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制可能與抑制穿孔素等效應(yīng)分子回收相關(guān)。 六、結(jié)論 NK細(xì)胞受靶細(xì)胞刺激后,穿孔素循clathrin途徑回收至早期內(nèi)體中。此效應(yīng)可被clathrin途徑的化學(xué)抑制劑或特異性siRNA抑制,并導(dǎo)致NK細(xì)胞殺傷功能下降。提示：穿孔素回收對維持NK細(xì)胞殺傷功能具有重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1659056