本文選題：帕金森病　切入點：ATP敏感性鉀通道　出處：《南京醫(yī)科大學》2012年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：帕金森�。≒arkinson’s disease, PD）是嚴重危害中老年人健康的的神經退行性疾病，在65歲以上人群中的發(fā)病率約為2%，預計未來十年我國罹患PD的人數將占世界PD患者的60%1。PD特征性的病理標志為中腦黑質致密部（Substantia nigra pars compacta, SNpc）多巴胺能（DAergic）神經元進行性丟失，臨床癥狀包括靜止性震顫、肌肉僵直、隨意運動遲緩和姿態(tài)不穩(wěn)等。研究發(fā)現遺傳因素和環(huán)境因素的相互作用在調節(jié)PD易感性中發(fā)揮重要作用。目前認為老化與PD發(fā)生最密切相關2。家族性PD中發(fā)現α-synuclein突變，開啟了PD研究的基因時代。近期研究發(fā)現反應性膠質細胞是PD中一個關鍵因素。星形膠質細胞和小膠質細胞通過分泌一系列促炎或抑炎細胞因子、抗氧化分子和神經營養(yǎng)因子在PD病理過程中發(fā)揮重要作用。這些調質成為雙刃劍，產生神經損傷和神經保護效應。目前，通過抑制神經炎癥、恢復線粒體功能和調節(jié)能量代謝從而調節(jié)膠質細胞功能已成為治療干預PD富有前景的策略。剖析神經元-膠質間相互作用的決定性調節(jié)因素將為發(fā)展治療PD的多潛能神經保護劑提供有益的靶標和思路。 ATP敏感性鉀通道（ATP-sensitive potassium channel，K-ATP通道）是一類耦聯(lián)細胞代謝和電活動、非電壓依賴性的特殊鉀離子通道。K-ATP通道由通道形成亞基內向整流鉀通道（inwardly rectified potassium channel，Kir）和調節(jié)亞基磺酰脲類受體（sulfonylureas，SUR）按4∶4比例組成的異源性八聚體（SUR/Kir6.X），其開閉由細胞的代謝狀態(tài)即ATP/ADP的水平決定。其中Kir為孔形成亞基，決定通道的離子選擇性，包括Kir6.1（KCNJ8）和Kir6.2（KCNJ11）兩種異構體，存在近71%相同氨基酸序列。SUR是調節(jié)亞基磺酰脲類受體，包括SUR1（ABCC8）和SUR2（ABCC9）兩種異構體。 K-ATP通道廣泛表達于中樞神經系統(tǒng)，但在不同細胞類型中亞基組成不盡相同。中腦DA神經元表達由Kir6.2和SUR1構成的K-ATP通道3-4，而星形膠質細胞和小膠質細胞則主要表達Kir6.1亞基，并且本實驗室前期研究發(fā)現神經干細胞表達Kir6.1亞基5。本實驗室前期研究及Liss B等均發(fā)現Kir6.2構成的K-ATP通道與PD的發(fā)生、發(fā)展相關6-7，應用Kir6.2敲除鼠的研究證實K-ATP通道選擇性調節(jié)黑質DA神經元的存活和死亡3，開放Kir6.1構成的K-ATP通道可通過調節(jié)膠質細胞功能，抑制其過度活化，促進神經再生與修復，發(fā)揮神經保護作用4。因此，不同細胞類型K-ATP通道亞基表達的不同提示，Kir6.1與Kir6.2構成的K-ATP通道的作用存在差異，那么表達于膠質細胞上Kir6.1構成的K-ATP通道如何參與調節(jié)MPTP/p PD模型小鼠的DA能神經元損傷及其機制，目前尚未見報道。 本文工作第一部分應用野生型（wild-type，WT）和Kir6.2敲除（Kir6.2knockout，Kir6.2-/-）小鼠，建立MPTP/p PD小鼠模型，在前期研究的基礎上進一步闡明Kir6.2缺失通過抑制內質網應激、增強自噬參與對PD進程中DA神經元的保護作用；并且離體培養(yǎng)WT及Kir6.2-/-原代星形膠質細胞，研究、闡明Kir6.2構成的K-ATP通道通過抑制神經元釋放α-synuclein調節(jié)星形膠質細胞功能；第二部分建立WT及Kir6.1+/-小鼠MPTP/p PD模型，研究、闡明Kir6.1構成的K-ATP與PD發(fā)生的相關性，并初步探討其可能的機制。本文工作的研究結果為K-ATP參與PD病程的發(fā)生、發(fā)展提供直接的支持證據，并闡明其在PD神經損傷中發(fā)揮多靶點的保護作用，為PD的臨床治療學提供新的思路和策略。 第一部分Kir6.2構成的K-ATP通道缺失對PD模型小鼠DA神經元保護作用的機制研究 目的：應用Kir6.2敲除小鼠，研究、闡明Kir6.2對MPTP/p PD模型小鼠神經損傷的調節(jié)作用及機制。 方法：應用3月齡野生型（wildtype，WT）及Kir6.2敲除（Kir6.2knockout，Kir6.2-/-）雄性C57BL/6J小鼠，MPTP皮下注射，繼而丙磺舒腹腔注射（MPTP20mg·kg-1，s.c.，丙磺舒250mg·kg-1，i.p.，一周2次，連續(xù)5周）建立MPTP/pPD小鼠模型。應用酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫組織化學結合體視學計數分析黑質致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）和腹側被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）DA能神經元的損傷，同時應用尼氏染色（Nissl staining）結合體視學計數分析黑質區(qū)（substantia nigra，SN）神經元的損傷；檢測黑質區(qū)星形膠質細胞的活化（glial fibrillary acidic protein，GFAP染色）。應用免疫組織化學和免疫熒光方法檢測SN區(qū)α-synuclein的沉積。Western-blotting法檢測SN區(qū)內質網應激標記物GRP78、CHOP和Caspase12，溶酶體自噬標志物LC3、P62，核轉錄因子NF-κB p65亞基的表達及能量感受器AMPK（AMP-activated protein kinase）的磷酸化水平；酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清TNF-α、IL-1β及SN區(qū)TNF-α蛋白水平的變化。分離、培養(yǎng)WT及Kir6.2-/-小鼠中腦星形膠質細胞。給予AMPK激動劑AICAR和抑制劑Compoud C及MPP+藥物處理，MTT法和LDH測定觀察MPP+對星形膠質細胞活力的影響。Western-blotting法觀察MPP+對WT、Kir6.2-/-星形膠質細胞AMPK磷酸化水平及核轉錄因子NF-κB p65亞基的表達。應用RT-PCR及Western-blotting法觀察中腦星形膠質細胞炎癥因子TNF-α、IL-1β及營養(yǎng)因子GDNF、FGF-2和BDNF的表達。 結果：1）基礎狀態(tài)下，兩種基因型小鼠SNpc區(qū)和VTA區(qū)TH神經元數量無顯著差異。MPTP模型制備成功后，WT小鼠SNpc區(qū)Nissl染色陽性神經元減少為正常對照的50%；SNpc區(qū)TH陽性神經元數量減少為正常對照的59%，VTA區(qū)為正常對照的21%。Kir6.2敲除逆轉了MPTP誘導的SNpc區(qū)DA神經元減少。2）Kir6.2敲除抑制MPTP/p誘導的SNc區(qū)星形膠質細胞增殖活化。3）MPTP引起WT小鼠SN區(qū)內質網應激增強，內質網應激中蛋白伴侶分子GRP78、轉錄因子CHOP、效應分子Caspase12表達上調，自噬受阻，溶酶體自噬標志物LC3、自噬底物P62表達水平增加，下游NF-κB信號通路激活。Kir6.2敲除抑制SN區(qū)內質網應激，增強自噬，并抑制下游NF-κB信號通路，抑制炎癥因子分泌。4）基礎狀態(tài)下，Kir6.2-/-小鼠中腦AMPK磷酸化水平顯著升高。MPTP誘導WT小鼠中腦AMPK磷酸化水平上調，Kir6.2-/-小鼠AMPK磷酸水平較WT小鼠升高更為顯著。5）Kir6.2敲除抑制基礎狀態(tài)和MPTP/p誘導的中腦SNc區(qū)α-synuclein蓄積。6）MPP+（50μM）作用48h可降低WT星形膠質細胞的活力，對Kir6.2-/-星形膠質細胞的活力無顯著影響。AICAR（10μM）抑制MPP+對中腦星形膠質細胞的損傷，Compound C（10μM）取消Kir6.2敲除對MPP+誘導中腦星形膠質細胞損傷的保護作用。7）Kir6.2敲除取消MPP+對中腦星形膠質細胞NF-κB的激活作用，抑制炎癥因子TNF-α和IL-1β的釋放；Kir6.2敲除上調營養(yǎng)因子FGF-2、BDNF及GDNF的蛋白水平。 結論： 1、闡明Kir6.2敲除抑制膠質細胞增殖活化，抑制內質網應激和神經炎癥，增強自噬，在小鼠MPTP/p PD模型中發(fā)揮神經保護作用。 2、闡明Kir6.2敲除通過抑制神經元分泌并釋放α-synuclein，，致星形膠質細胞攝取減少，引起星形膠質細胞炎癥因子分泌減少，營養(yǎng)因子分泌增加，參與對MPP+誘導的中腦多巴胺能神經元損傷的保護作用。 第二部分Kir6.1構成的K-ATP通道在MPTP/p PD模型小鼠神經損傷中的作用 目的：應用Kir6.1雜合子小鼠，研究、闡明Kir6.1構成的K-ATP通道與PD發(fā)生的相關性。 方法：應用3月齡野生型（wildtype，WT）及Kir6.1雜合子（Kir6.1heterozygote，Kir6.1+/-）雄性C57BL/6J小鼠，應用Western-blotting法檢測Kir6.1+/-小鼠中腦及紋狀體Kir6.1蛋白的表達變化。應用MPTP皮下注射，繼而丙磺舒腹腔注射（MPTP20mg·kg-1，s.c.，丙磺舒250mg·kg-1，i.p.，一周2次，連續(xù)5周）建立MPTP/p PD小鼠模型。應用TH免疫組織化學結合體視學計數分析SNpc和VTA DA能神經元的損傷；同時檢測SNpc和VTA GFAP染色、小膠質細胞的活化（Macrophage antigen complex1，MAC-1染色）以及室管膜下層（subventricular zone，SVZ）和顆粒細胞下層（subgranular zone，SGZ）神經再生的變化（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU免疫組化）。應用高效液相色譜法（HPLC）檢測紋狀體腦區(qū)單胺類及氨基酸類神經遞質及其代謝產物水平的變化。應用Western-blotting法檢測SN區(qū)內質網應激標記物CHOP和Caspase12，溶酶體自噬標志物LC3、P62，核轉錄因子NF-κB p65亞基的表達及營養(yǎng)因子GDNF、FGF-2和BDNF的表達變化。應用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β蛋白水平的變化。應用Realtime PCR法檢測SN區(qū)促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6及抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA變化。 結果：1）基礎狀態(tài)下，兩種基因型小鼠SNpc區(qū)和VTA區(qū)TH神經元數量無顯著差異，紋狀體DA及其代謝產物水平無顯著差異（p0.05）。MPTP模型制備成功后，兩種基因型小鼠均發(fā)生SN區(qū)神經元損傷，Kir6.1+/-小鼠神經元損傷更為嚴重（p0.05）。WT小鼠SNpc區(qū)TH陽性神經元存活率為59%，Kir6.1+/-小鼠TH陽性神經元存活率為46%。WT和Kir6.1+/-小鼠VTA區(qū)TH神經元存活率分別為78%和71%。MPTP模型成功后，WT和Kir6.1+/-小鼠紋狀體DA及其代謝產物水平均顯著降低（p0.05），但兩種基因型之間無顯著差異（p0.05）。2）基礎狀態(tài)下，兩種基因型小鼠SN區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞數量無顯著差異，僅出現少數GFAP、MAC-1陽性染色。MPTP引起WT小鼠SN區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞顯著增殖活化，Kir6.1+/-小鼠SN區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞增殖活化更為顯著（p0.05）。3）基礎狀態(tài)下Kir6.1+/-小鼠SVZ區(qū)BrdU陽性細胞數顯著少于WT小鼠（p0.05）。MPTP模型成功后，SVZ和SGZ區(qū)神經干細胞數量減少，兩種基因型小鼠無顯著差異（p0.05）。4）MPTP誘導WT小鼠產生神經炎癥反應，增加SN區(qū)NF-κB p65亞基核轉位，引起促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6mRNA水平增加，抑炎因子IL-10、TGF-β mRNA水平降低，并伴有外周血清TNF-α、IL-1β產生增加；同時，MPTP誘導內質網應激增強，內質網特異性轉錄因子CHOP、效應分子Caspase12表達上調，自噬功能受到抑制，溶酶體自噬標志物LC3、自噬底物P62表達均上調。而MPTP引起Kir6.1+/-小鼠炎癥反應加劇，內質網應激增強，自噬功能減弱，協(xié)同加重DA神經元損傷。5）基礎狀態(tài)下，兩種基因型小鼠中腦營養(yǎng)因子GDNF、FGF-2及BDNF表達水平無顯著差異。MPTP誘導WT小鼠營養(yǎng)因子GDNF、FGF-2表達增加，BDNF表達降低；但MPTP不影響Kir6.1+/-小鼠GDNF、FGF-2的表達，卻進一步加重BDNF表達降低的現象。 結論： 1、應用Kir6.1雜合子小鼠，發(fā)現Kir6.1構成的K-ATP通道與PD的發(fā)生密切相關。 2、闡明Kir6.1構成的K-ATP通道通過調節(jié)膠質細胞功能（加增強營養(yǎng)支持功能，抑制神經炎癥），促進神經再生，在PD中發(fā)揮神經保護作用。 綜上所述，本文工作的主要創(chuàng)新之處在于： 1、應用Kir6.2-/-小鼠，闡明Kir6.2敲除逆轉MPTP/p誘導的SNc區(qū)DA神經元損傷，其機制與抑制內質網應激和神經炎性反應，增強自噬水平相關；為深化對PD發(fā)生發(fā)展的認識積累了重要的學術基礎，也為PD臨床治療學的突破提供了新的思路。 2、揭示Kir6.2構成的K-ATP通道通過調節(jié)神經元α-synuclein的釋放影響星形膠質細胞功能。進一步證實星形膠質細胞在PD發(fā)生中的重要作用，為靶向于星形膠質細胞功能調節(jié)藥物應用于PD等神經系統(tǒng)疾病的臨床治療提供了理論依據。 3、應用Kir6.1+/-小鼠，發(fā)現Kir6.1構成的K-ATP通道與PD的發(fā)生密切相關。Kir6.1基因缺失加重MPTP誘導的SNc區(qū)DA神經元損傷，其機制與誘導膠質細胞活化，損傷膠質細胞功能，加重MPTP引起的神經再生抑制相關。研究結果豐富了K-ATP通道在PD神經損傷中的作用機制，為PD的臨床治療提供了有益的靶標和策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R742.5;R-332

【共引文獻】

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本文編號：1599178