本文選題：惡性瘧原蟲　切入點(diǎn)：瘧疾疫苗　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2011年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：瘧疾仍是嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病。由于瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散,以及蚊媒對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生抗性并逐漸蔓延,使得傳統(tǒng)的瘧防措施面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。研發(fā)安全、有效的瘧疾疫苗是當(dāng)今最有希望的瘧疾防治方法之一。瘧疾相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查以及實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果均表明,研制有效的瘧疾疫苗是可行的。長期在瘧疾流行區(qū)生活的居民體內(nèi)可以產(chǎn)生針對(duì)瘧疾的免疫力,在高瘧區(qū),10歲以上的人群極少發(fā)生重癥瘧疾。從長期生活在西非瘧疾流行區(qū)的成年人體內(nèi)提取的IgG,被動(dòng)免疫治療重癥瘧疾患兒,能使其外周血原蟲密度降低99%。此外,給志愿者反復(fù)接種經(jīng)輻照減毒的瘧原蟲子孢子,可使人體產(chǎn)生完全的保護(hù)性免疫力。這些研究結(jié)果為研制有效瘧疾疫苗提供了重要依據(jù)。瘧疾疫苗研究已進(jìn)行了近三十年,目前已鑒定了一批包含瘧原蟲生活史各期的疫苗候選抗原。這些抗原在動(dòng)物試驗(yàn)中都能產(chǎn)生較高水平的特異性抗體,并且在體外或動(dòng)物模型中顯示出不同程度的保護(hù)效力,其中一些疫苗候選抗原已進(jìn)入臨床研究,并顯示出較好的免疫保護(hù)效果,如以惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白為基礎(chǔ)的RTS,S瘧疾疫苗已進(jìn)入III期臨床試驗(yàn),其疫苗制劑RTS,S/ AS01E在非洲兒童中進(jìn)行的臨床試驗(yàn)顯示出一定的保護(hù)力(39.2%～45.8%),能持續(xù)15個(gè)月以上。然而,瘧疾疫苗研發(fā)仍面臨一些的困難,包括:(1)瘧疾免疫保護(hù)機(jī)制尚不清楚,現(xiàn)有疫苗候選抗原免疫原性較弱,單獨(dú)使用不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)效力;(2)缺乏有效的動(dòng)物模型以評(píng)價(jià)疫苗的體內(nèi)免疫保護(hù)效力;(3)瘧原蟲抗原變異和存在多種免疫逃避的機(jī)制;(4)缺乏強(qiáng)效人用疫苗佐劑等。 研制由瘧原蟲生活史多個(gè)時(shí)期抗原組成的多期聯(lián)合疫苗是當(dāng)今瘧疾疫苗的發(fā)展趨勢。由于瘧原蟲生活史復(fù)雜,瘧原蟲抗原有明顯期特異性和株間變異,因此普遍認(rèn)為,一個(gè)有效的疫苗需要由針對(duì)多個(gè)生長環(huán)節(jié)的抗原組成,這樣可增強(qiáng)疫苗的有效性和克服瘧原蟲變異性等問題。特別是將紅內(nèi)期抗原與紅外期抗原聯(lián)合,這種聯(lián)合疫苗對(duì)紅內(nèi)期和紅外期原蟲均能產(chǎn)生殺滅作用。此外,選用合適的人用佐劑也是瘧疾疫苗研發(fā)的重要內(nèi)容。研究已表明,瘧疾保護(hù)性免疫需要相當(dāng)高的免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此需要尋找或研制一種能在人體應(yīng)用的強(qiáng)效佐劑,并與瘧疾疫苗抗原聯(lián)合應(yīng)用。 本實(shí)驗(yàn)室在瘧疾疫苗研發(fā)方面已開展了系列工作。PfCP-2.9抗原是由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)和研制的一種紅內(nèi)期瘧疾疫苗候選抗原,該抗原是由惡性瘧原蟲裂殖子表面抗原1(MSP1)和頂端膜抗原1(AMA-1)的C-末端片段融合而成。在前期的實(shí)驗(yàn)室和臨床研究中,該抗原顯示出良好的發(fā)展前景:(1)在畢氏酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)產(chǎn)量高,且可溶性和穩(wěn)定性高;(2)在小鼠、家兔、猴動(dòng)物模型中均顯示較強(qiáng)的免疫原性,在家兔中能誘導(dǎo)產(chǎn)生較單個(gè)組分高10倍以上的抗體;(3)家兔和恒河猴的免疫血清在體外有良好的抑制瘧原蟲生長的效力;(4)兩次臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該抗原在人體具有良好的安全性和免疫原性。然而,PfCP-2.9融合抗原的構(gòu)象是個(gè)尚未解決重要問題,特別是這兩個(gè)二硫鍵十分豐富的蛋白融合為一個(gè)分子后,是否能形成各自的正確構(gòu)象以及兩個(gè)抗原是否存在相互作用等問題,均受到普遍關(guān)注。 本研究采用多維核磁共振NMR技術(shù)對(duì)PfCP-2.9蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。我們制備了15N單標(biāo)記和13C、15N雙標(biāo)記PfCP-2.9重組蛋白以及15N單標(biāo)記PfMSP119重組蛋白,通過將融合蛋白中指認(rèn)的氨基酸化學(xué)位移與已知單個(gè)組分氨基酸化學(xué)位移的對(duì)比,分析其結(jié)構(gòu)變化。此外,我們開展了以PfCP-2.9和PfCSP-2抗原為基礎(chǔ)的多期聯(lián)合疫苗的免疫學(xué)和臨床前研究。本研究取得主要結(jié)果如下: (一)PfCP-2.9疫苗候選抗原的結(jié)構(gòu)解析 為研究PfCP-2.9抗原的三維結(jié)構(gòu),我們?cè)诋叧嘟湍副磉_(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了15N單標(biāo)記、15N、13C雙標(biāo)記PfCP-2.9蛋白及15N單標(biāo)記PfMSP119蛋白,用于NMR分析。在制備樣本的過程中,我們遇到了蛋白降解和表達(dá)量低等問題。通過采用小型罐發(fā)酵以及嚴(yán)格控制和優(yōu)化發(fā)酵條件等途徑,獲得了用于磁共振分析的蛋白樣品。 HNCA,HNCACB,CBCA(CO)NH,HNCO和HN(CA)CO實(shí)驗(yàn)被用來進(jìn)行主鏈原子信號(hào)指認(rèn);HBHA(CO)NH,(H)CC(CO) NH,CC(CO)NH和15N-TOCSY-HSQC實(shí)驗(yàn)被用來進(jìn)行側(cè)鏈原子信號(hào)指認(rèn)。對(duì)主鏈碳原子的指認(rèn)獲得的數(shù)據(jù)如下:分別指認(rèn)了PfAMA1-III、連接區(qū)、PfMSP119部分的39個(gè)、12個(gè)和71個(gè)氨基酸殘基;同時(shí)獲得了部分側(cè)鏈的化學(xué)位移數(shù)據(jù)。PfAMA1-III部分被指認(rèn)的殘基定位分散于分子的不同區(qū)域,包含有結(jié)構(gòu)區(qū)域和無序區(qū)域,且許多位于核心結(jié)構(gòu)區(qū)的殘基被指認(rèn);PfMSP119部分大多數(shù)氨基酸殘基均被指認(rèn)。 三維15N-標(biāo)記NOESY-HSQC波譜實(shí)驗(yàn)用來分析化學(xué)位移。絕大多數(shù)PfCP-2.9分子中被指認(rèn)的氨基酸殘基表現(xiàn)出的化學(xué)位移與已報(bào)道的單個(gè)組分的化學(xué)位移高度相似。僅有少量氨基酸的化學(xué)位移與已報(bào)道的數(shù)據(jù)有較大差異,由于在已報(bào)道的PfAMA1-III和PfMSP119的NMR研究中,與本項(xiàng)研究使用的緩沖液條件不同,因此這些差異被考慮為實(shí)驗(yàn)條件差異所致。 將PfCP-2.9與PfMSP119的HSQC圖譜進(jìn)行重疊,結(jié)果顯示PfCP-2.9分子中的PfMSP119的結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的PfMSP119分子的結(jié)構(gòu)完全一致。除了His150和Ser238殘基,所有氨基酸殘基的化學(xué)位移峰的差別都在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。His150和Ser238殘基分別位于兩種分子的N端和C端,易受樣品條件不同的影響。經(jīng)過對(duì)比兩種分子的波譜圖,未發(fā)現(xiàn)任何信號(hào)消失。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)有力地證明了PfCP-2.9分子中的PfMSP119部分的結(jié)構(gòu)與單獨(dú)的PfMSP119分子的結(jié)構(gòu)完全一致。 將15N單標(biāo)記PfCP-2.9與PfMSP119同時(shí)進(jìn)行橫向馳豫率的測定,結(jié)果顯示,位于PfCP-2.9分子的氨基酸殘基的橫向馳豫率整體較高,這是因?yàn)镻fCP-2.9分子具有較高的分子量和較慢的分子翻轉(zhuǎn)。將兩種分子中的數(shù)據(jù)進(jìn)行重疊,發(fā)現(xiàn)兩者有極高的相似度,未在任何區(qū)域發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別。該結(jié)果提示PfCP-2.9分子中的PfMSP119部分與單獨(dú)的PfMSP119分子相比,沒有氨基酸殘基化學(xué)或構(gòu)象的變化,提示PfMSP119部分與PfAMA1-III部分和連接區(qū)部分無微弱的相互作用。 (二)多期聯(lián)合瘧疾疫苗免疫學(xué)及臨床前研究 為研制多期聯(lián)合瘧疾疫苗,本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建了惡性瘧原蟲紅外期抗原PfCSP-2。該抗原由由惡性瘧原蟲3D7株的環(huán)子孢子蛋白(CSP)的NANP重復(fù)區(qū)及C端部分側(cè)翼序列融合而成。在前期的實(shí)驗(yàn)中,該疫苗候選抗原也顯示出良好的發(fā)展前景,包括在畢氏酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)中高水平表達(dá)、蛋白可溶和穩(wěn)定性高、純化制備簡便,并在小鼠、家兔動(dòng)物模型中均顯示出很高的免疫原性等。在此基礎(chǔ)上本研究開展了多期聯(lián)合疫苗多種動(dòng)物的免疫學(xué)、新型佐劑以及臨床前相關(guān)研究: 1.新型佐劑選用:疫苗的組成包括兩個(gè)方面,一是抗原,二是佐劑。作為疫苗,佐劑的作用與抗原同等重要,特別是目前尚缺乏人用強(qiáng)效佐劑。為此,本項(xiàng)研究選用了5種人用疫苗佐劑或組合:MF59、GLA、MF59+GLA、鋁佐劑+GLA、鋁佐劑+CpG,并在小鼠和恒河猴體內(nèi)進(jìn)行了佐劑比較研究。 BALB/c小鼠8組,每組8只小鼠,分別免疫M(jìn)F59+GLA、MF59、GLA、ISA720、弗氏佐劑、鋁佐劑、鋁佐劑+GLA與PfCP-2.9蛋白的疫苗制劑。頸背部皮下注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結(jié)果顯示除了弗氏佐劑和ISA720兩種非人用佐劑外,鋁佐劑+GLA+抗原組特異性抗體水平最高,從該組免疫血清中純化的抗體顯示出一定的體外抑制原蟲生長效力。 恒河猴5組,每組3只恒河猴,分別免疫ISA720、鋁佐劑+CpG、鋁佐劑+GLA、鋁佐劑、MF59+GLA與PfCP-2.9+PfCSP-2蛋白的疫苗制劑。大腿肌肉注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鋁佐劑+GLA組PfCP-2.9特異性抗體水平最高,其純化的抗體顯示出明顯的體外抑制瘧原蟲生長效力。 綜合考慮目前在臨床前及臨床試驗(yàn)中佐劑應(yīng)用的實(shí)際情況和佐劑的安全性等問題,以及佐劑的實(shí)際效果需要在臨床試驗(yàn)中才能體現(xiàn)等實(shí)際情況,經(jīng)與世界衛(wèi)生組織和美國IDRI專家研討,確定鋁佐劑+GLA為本疫苗的佐劑。 2.兩種抗原劑量配比:在實(shí)際應(yīng)用時(shí),多期聯(lián)合瘧疾疫苗面臨著兩種抗原劑量如何配比的問題,為此我們?cè)谛∈竽Ｐ椭羞M(jìn)行了最佳劑量配比實(shí)驗(yàn)。BALB/c小鼠5組,每組6只小鼠,PfCP-2.9:PfCSP-2的量分別為1:1、1:2、2:1、1:4、4:1。頸背部皮下注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結(jié)果顯示抗原配比1:1組PfCP-2.9抗體水平略高,其次為4:1、2:1、1:2、1:4組,統(tǒng)計(jì)分析顯示各組間均無顯著差異;第1~4組PfCSP-2抗體水平接近,以抗原配比1:2組略高,其次為1:4、1:1、2:1組,4:1組抗體水平明顯較低,統(tǒng)計(jì)分析顯示第1:2、1:4、1:1、2:1組間無顯著差異,但均明顯高于4:1組(p0.05)。綜合上述結(jié)果,我們確定兩種抗原以1:1配比進(jìn)行下階段的實(shí)驗(yàn)。 3.兩種抗原相互競爭性抑制分析:為了分析PfCP-2.9與PfCSP-2抗原聯(lián)合免疫時(shí)是否存在相互競爭性抑制作用,我們?cè)谛∈蠛图彝脛?dòng)物模型中進(jìn)行了分析。BALB/c小鼠4組,每組6只小鼠;家兔4組,每組5只家兔,分組包括:PfCP-2.9組、PfCSP-2組、PfCP-2.9+PfCSP-2聯(lián)合組合生理鹽水對(duì)照組。頸背部皮下注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結(jié)果顯示單獨(dú)的抗原組與聯(lián)合抗原組產(chǎn)生的特異性抗體水平接近,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析均無顯著差異,表明兩種抗原聯(lián)合免疫無明顯競爭性抑制作用。 4.免疫原性及體外抑制效力分析:在確定了合適的佐劑、合適的抗原劑量配比和證實(shí)了抗原之間無相互競爭性抑制作用的基礎(chǔ)上,我們?cè)谛∈蟆⒓彝煤秃愫雍飫?dòng)物模型中開展了由新型佐劑多期與兩個(gè)疫苗抗原組成的聯(lián)合瘧疾疫苗(PfCP-2.9+PfCSP-2 /Al+GLA)的免疫原性實(shí)驗(yàn)以及體外抑制原蟲生長效力的分析。BALB/c小鼠4組,每組6只小鼠,分組包括:PfCP-2.9+PfCSP-2/Al+GLA組、Al+GLA對(duì)照組、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al組、Al對(duì)照組;家兔4組,每組5只家兔,分組包括:PfCP-2.9組、PfCSP-2組、PfCP-2.9+PfCSP-2聯(lián)合組合生理鹽水對(duì)照組;恒河猴2組,每組5只恒河猴,分組包括:PfCP-2.9+PfCSP-2 /Al+GLA組、PfCP-2.9+PfCSP-2/Al組;頸背部皮下或肌肉注射共免疫3次,每次免疫后取血。采用ELISA方法檢測免疫血清的特異性抗體水平,結(jié)果在小鼠、家兔和恒河猴動(dòng)物模型中,該疫苗均顯示出良好的免疫原性,能刺激動(dòng)物產(chǎn)生較高水平的特異性抗體,聯(lián)合佐劑Al+GLA較單獨(dú)Al佐劑組抗體水平高,免疫血清能識(shí)別天然抗原,并在體外顯示出一定的抑制瘧原蟲生長效力。 5.疫苗穩(wěn)定性初步觀察:為了觀察該新型多期聯(lián)合瘧疾疫苗的穩(wěn)定性,我們采用以引起動(dòng)物免疫應(yīng)答的效力進(jìn)行評(píng)估,即測定半數(shù)有效劑量ED50。該方法是將多價(jià)多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原保存在4℃和37℃條件下,取不同時(shí)間點(diǎn)的多價(jià)多期聯(lián)合瘧疾疫苗抗原,連續(xù)稀釋5個(gè)稀釋度,與鋁+GLA佐劑混合后接種BALB/c小鼠,每個(gè)稀釋度10只,雌雄各半。4周后采血取血清,用ELISA法測定血清樣本,計(jì)算ED50值。結(jié)果顯示,4℃條件下6個(gè)月內(nèi)和37℃條件下7天內(nèi)的疫苗樣品,其半數(shù)有效劑量ED50保持在穩(wěn)定水平,無顯著差異,表明疫苗抗原在凍干狀態(tài)下至少能在4℃條件下6個(gè)月內(nèi)和37℃條件下7天內(nèi)保持其免疫效力的穩(wěn)定。 小結(jié):多期聯(lián)合瘧疾疫苗是有希望的瘧防新措施,在本實(shí)驗(yàn)室對(duì)瘧疾疫苗長期研究的基礎(chǔ)上,本項(xiàng)研究開展了對(duì)PfCP-2.9疫苗候選抗原的結(jié)構(gòu)解析和多期聯(lián)合瘧疾疫苗免疫學(xué)及臨床前研究。結(jié)果顯示:(1)AMA1-III和MSP119在PfCP-2.9分子中均具有良好的結(jié)構(gòu),并維持了其天然構(gòu)象;(2)PfCP-2.9分子中的AMA1-III和MSP119組分無相互作用;(3)比較了多種人用佐劑的作用,選擇了Al+GLA作為新型疫苗的佐劑;(4)PfCP-2.9與PfCSP-2兩種抗原1:1是合適的抗原配比;兩種抗原在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)無明顯的競爭性抑制作用;(5)新型多期聯(lián)合瘧疾疫苗PfCP-2.9+PfCSP-2 /Al+GLA在小鼠、家兔和恒河猴動(dòng)物模型中均顯示出良好的免疫原性,其抗體顯示出一定的體外抑制原蟲生長效果;(6)兩種抗原制劑在凍干狀態(tài)下,至少能在4℃條件下6個(gè)月內(nèi)和37℃條件下7天內(nèi)保持其免疫效力的穩(wěn)定。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 李偉杰;約氏瘧原蟲Pys25和Pys48抗原在大腸桿菌和家蠶細(xì)胞中的表達(dá)與初步研究[D];浙江理工大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1599165