發(fā)布時間：2017-12-27 12:01

  本文關鍵詞：表達人呼吸道合胞病毒結構蛋白的重組腺病毒及桿狀病毒的構建與鑒定　出處：《北京交通大學》2011年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 人呼吸道合胞病毒 非復制型第一代腺病毒載體 桿狀病毒表達載體 黏附蛋白 融合蛋白 基質蛋白

【摘要】：目的：人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus, RSV)廣泛分布于世界各地,是導致嬰幼兒、老年人和免疫缺陷病人嚴重下呼吸道感染的最重要的病毒病原。RSV屬于副粘病毒科肺病毒屬,基因組為15.2 Kb的單股負鏈RNA,編碼11種蛋白,其中黏附蛋白(Glycoprotein, G)和融合蛋白(Fusion protein,F)為RSV主要中和抗原,基質蛋白(Matrix protein, M)為RSV的骨架蛋白。從福爾馬林滅活疫苗開始,已研制了多種形式的RSV疫苗,但由于安全性和免疫原性等問題,至今尚沒有能夠用于預防人RSV感染的疫苗問世。病毒樣顆粒疫苗作為一種新型疫苗形式被廣泛用于各種病毒疫苗研制,并獲得較為理想的免疫效果和保護作用。迄今為止,人們對于RSV病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)的制備條件尚處探索階段,僅有的一個關于RSV VLPs見于2008年美國一份專利申請書,但存在產量低、制備困難及未見免疫效果和免疫保護作用研究。本研究擬選用非復制型第一代腺病毒載體(First generation replication deficient recombinant adenoviral vector, FGAd)和桿狀病毒表達載體分別構建表達RSV F、G、M的復制缺陷型重組腺病毒及重組桿狀病毒,為進一步闡明RSV VLPs形成和出芽機制,以及獲得RSV VLPs奠定實驗基礎。 方法：參考GenBank登錄的RSV A亞型Long株M、G蛋白基因序列,按照哺乳動物細胞密碼子偏性,對M和G基因進行密碼子優(yōu)化,然后分別克隆到穿梭載體pShuttle-CMV,再經同源重組獲得重組腺病毒質粒,分別轉染293細胞,獲得重組腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-Msyn, Western-blot鑒定目的基因表達。參考GenBank登錄的RSV A亞型Long株F、G和M蛋白基因序列,按照昆蟲細胞密碼子偏性,對F、G和M基因進行密碼子優(yōu)化,然后分別克隆到穿梭載體pFast-BacⅠ,轉座后獲得重組桿狀病毒質粒,分別轉染sf9細胞,獲得重組桿狀病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt, Western-blot鑒定目的基因表達。 結果：重組腺病毒DNA分子轉染293細胞后,7d左右細胞出現腫脹,圓縮等典型的致細胞病變效應(Cytopathic effect, CPE), Western blot檢測到G和M基因的表達,獲得非復制型重組腺病毒FGAd-Gsyn和FGAd-Msyn。重組桿狀病毒質粒轉染sf9細胞后,3d后出現細胞腫脹、細胞核增大和核內出現空泡等病變,Western blot檢測到F、G和M基因的表達,獲得重組桿狀病毒rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt o 結論：成功獲得FGAd-Gsyn、FGAd-Msyn、rBac-Fopt、rBac-Mopt和rBac-Gopt,為闡明RSV VLPs形成和出芽機制,以及獲得RSV VLPs奠定了實驗基礎。
[Abstract]:Objective: Human respiratory syncytial virus (RSV) is widely distributed all over the world, and is the most important viral pathogen causing severe lower respiratory tract infection in infants, elderly and immunodeficiency patients. RSV belongs to the paramyxovirus family, belonging to the paramyxovirus family. The genome is a single strand negative chain RNA of 15.2 Kb, encoding 11 proteins. The Glycoprotein G and fusion protein (Fusion protein, F) are the main neutralizing antigens of RSV, and the matrix protein (Matrix protein) is the bone scaffold protein. Since the initiation of formalin inactivated vaccine, various forms of RSV vaccine have been developed, but because of safety and immunogenicity, there is no vaccine available to prevent human RSV infection. As a new type of vaccine, virus like vaccine has been widely used in the development of various virus vaccines, and has obtained more ideal immune effect and protective effect. So far, the RSV virus like particles (Virus-like, particles, VLPs) the preparation conditions is still in the stage of exploration, the only one on the RSV VLPs in 2008 a U.S. patent application, but there are low yield, difficult preparation and no immunological effect and protective effect of. This study intends to use non replicating first generation adenovirus vector (First generation replication deficient recombinant adenoviral vector, FGAd) and baculovirus expression vector were used to construct recombinant adenovirus and recombinant baculovirus expressing RSV F, G, M, VLPs and RSV in order to further clarify the formation mechanism of budding, and get RSV VLPs lay the experimental basis.
【學位授予單位】：北京交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R373

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本文編號：1341605