第一章 文獻(xiàn)綜述

中國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國與消費國，2009年英美煙草全球業(yè)績報告顯示，中國煙草占全球市場份額的41.4%，在烤煙種植面積、烤煙產(chǎn)量、卷煙產(chǎn)量、銷量額、卷煙產(chǎn)量銷量增長量、吸煙人口、吸煙人口增長率以及煙草利稅等方面均居全球第一(孔宏偉 2010)。2003年5月21日，中國代表團參加第56屆世界衛(wèi)生大會，并正式簽署了《煙草控制框架公約》，成為了該公約的第77個締約國(陳振華 2013)，根據(jù)公約精神，我國煙草產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售、稅收等多個方面均受到更加嚴(yán)格的限制。

煙葉在種植、烘烤、倉儲、加工等過程中極易受到病蟲害的侵染。2002年，中國煙葉生產(chǎn)購銷公司調(diào)查發(fā)現(xiàn)，花葉病、蝕紋病、馬鈴薯Y病毒病、黑脛病、赤星病等68種煙草侵害性病害以及煙蚜、煙青蟲等害蟲對煙葉危害較為嚴(yán)重。2007年，煙草全國病蟲害發(fā)生面積達(dá)到83.15萬公頃，直接產(chǎn)量損失高達(dá)9.4萬噸(趙百東 2012)。因此，農(nóng)藥的使用必不可少。煙葉中農(nóng)藥的殘留是消費者普遍關(guān)心的問題，國際煙草科學(xué)研究合作中心(CORESTA)農(nóng)用化學(xué)品咨詢委員會(ACAC)在2003年提出了煙草農(nóng)藥殘留最高指導(dǎo)性限量，其中對99種農(nóng)藥的殘留限量做了規(guī)定，2008年的第二版擴展至118種(CORESTA2008)，2013年的第三版中擴展至120種(CORESTA 2013)。除此之外，目前國際上已有29個國家及地區(qū)(包括14個歐洲國家、9個亞洲國家或地區(qū)、4個非洲國家以及1個北美國家)對煙草農(nóng)殘?zhí)岢隽讼蘖恳�。因此，建立高靈敏度、高選擇性、更快速、更可靠的煙草農(nóng)殘檢測方法十分必要。

1.1 研究背景
1.1.1 煙葉農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀
1.1.1.1 農(nóng)藥及其使用簡介

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)所使用藥劑的總稱，又稱為農(nóng)用化學(xué)品(Agricultural chemicals,Agrochemical)或作物保護劑(Crop protection agents，CPA)。中國地理環(huán)境和氣候條件復(fù)雜，農(nóng)作物品種以及病蟲草鼠害種類很多，每年發(fā)生的受害面積達(dá)到 30 多億畝。因此，農(nóng)藥作為一種重要的病蟲害防治手段，能夠更加快速、有效、經(jīng)濟地防治有害生物，可以確保農(nóng)業(yè)豐收，在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用農(nóng)藥，可挽回數(shù)倍乃至數(shù)十倍的經(jīng)濟效益損失。中國是農(nóng)藥的生產(chǎn)和使用大國，我國每年農(nóng)藥的生產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到了 265 萬噸(王茂華等2012)，其中殺蟲劑 71.1 萬噸，占總產(chǎn)量的 26.9%；殺菌劑 15.2 萬噸，占總產(chǎn)量的 5.7%；除草劑 117.3 萬噸，占總產(chǎn)量的 44.3%。2013 年 1-12 月中國累計生產(chǎn)化學(xué)農(nóng)藥 318.95萬噸，比 2012 年同增長了 1.64%。

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1.2 農(nóng)殘分析方法的發(fā)展概況
農(nóng)藥殘留分析是指利用現(xiàn)代技術(shù)對食品及環(huán)境當(dāng)中存在的含量水平為微量、痕量以及超痕量的殘留于其中的農(nóng)藥成分進(jìn)行定性及定量檢測。農(nóng)殘分析的困難程度較高。首先，食品、煙草、環(huán)境當(dāng)中殘留農(nóng)藥的濃度水平極低，一般在 ng、pg 甚至 fg(10-9-10-15g)級別，需要對殘留農(nóng)藥的性質(zhì)以及各種分析方法有深刻的理解，否則容易造成誤判；其次，農(nóng)藥種類繁多，農(nóng)民在各種農(nóng)作物種植過程中選擇農(nóng)藥的范圍較大，且各地區(qū)使用的農(nóng)藥都有較大差異性，因此，分析的目標(biāo)物質(zhì)的不確定性較為突出，極大地增加了分析的難度；另外，不斷有新的農(nóng)藥投入市場，分析的方法也需要不斷更新。

根據(jù)分析目標(biāo)物的種類及數(shù)量，農(nóng)殘分析方法分為兩種類型，，分別是單殘留方法、多殘留方法。單殘留方法指的是針對某一種農(nóng)藥進(jìn)行定性及定量分析，一般用于農(nóng)藥注冊登記時進(jìn)行的相關(guān)分析，如最大殘留限量制定、具有特定目的農(nóng)藥分析或性質(zhì)研究。例如，利用氣相色譜法(GC)檢測新鮮煙葉或烤煙中的菌核凈成分的方法便是屬于單殘留方法(Liu et al. 2007)；多殘留分析方法指的是一次分析兩種或兩種以上農(nóng)藥種類的分析方法，這種分析方法也可以進(jìn)一步細(xì)分，例如，只分析同一類農(nóng)殘的分析方法，這種方法又被稱為選擇性多殘留方法(Selective multi-residue methods)，如 Vagi et al.(2007)等建立的利用超聲波輔助提取結(jié)合 GC-ECD 檢測海洋沉積物中的有機氯農(nóng)藥殘留方法；另一種多殘留方法為一次分析多類及多種農(nóng)藥殘留，也被稱為多類多殘留方法(Multi-classmulti-residue methods)，如 Golge et al.(2015)所建立的利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析橙子中 115 種農(nóng)藥殘留的方法。除此之外，目前發(fā)展的分析方法還包括同時用于分析農(nóng)殘、環(huán)境污染物、添加劑等多種有害成分的方法(Han et al. 2014)。由于農(nóng)殘含量水平極低，不同的分析方法可能會造成分析結(jié)果有所差異。為減少誤差，需要對分析過程進(jìn)行優(yōu)化。圖 1-1 表示一般農(nóng)殘分析的步驟及具體操作。目前，農(nóng)殘分析方法種類很多，但基本步驟包括樣品采集及儲存、樣品前處理、樣品分析及數(shù)據(jù)分析四個部分。其中樣品前處理過程及樣品的分析過程是農(nóng)殘分析方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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第二章 煙葉中農(nóng)藥多殘留的 GC/MS/MS 分析方法建立

2.1 前言
煙葉中農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)受到了消費者以及煙草加工行業(yè)的廣泛關(guān)注，農(nóng)藥多殘留分析方法的建立是實現(xiàn)煙葉安全品質(zhì)高效監(jiān)管的必要條件。由于煙葉中農(nóng)藥殘留水平較低，一般在 ng 級別，因此，建立超靈敏度(LOQ<50 ng/g)和高選擇性的檢測方法很有必要。近些年來，樣品的前處理技術(shù)如超聲波輔助提取技術(shù)、固相萃取技術(shù)、加速溶劑萃取技術(shù)、QuEChERS 技術(shù)等已有很大進(jìn)步，使得煙葉農(nóng)殘的分析更加快速、高效。分析儀器的發(fā)展更為分析領(lǐng)域帶來了便利，例如，氣相色譜(GC)或液相色譜(LC)與質(zhì)譜檢測器(MS)的聯(lián)用，甚至與三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的聯(lián)用，使分析儀器的靈敏度與選擇性大大提高。

QuEChERS 是一種目前較為流行的農(nóng)殘檢測樣品前處理方式，由英文單詞 quick、easy、cheap、effective、rugged 以及 safe 六個單詞的首字母縮寫，該方法由 Lehotay 小組于 2003 年建立，是農(nóng)藥殘留分析領(lǐng)域中發(fā)展最快的方法之一，具有快速、簡便、成本低廉、高效、適應(yīng)性強以及操作安全等優(yōu)點。利用這種方法所得到的待檢樣品可以同時用于液相色譜或氣相色譜分析。十幾年的發(fā)展過程中，該方法已經(jīng)有了許多不同的版本。研究人員通過對其中目標(biāo)物提取方法、基質(zhì)成分凈化等各個環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)整，并將其廣泛用在了水果、蔬菜、茶葉、煙葉中農(nóng)殘的分析當(dāng)中(王連珠 2012；郭春景 2013；陳建彪 2013；張媛媛 2014)。除此之外，利用這種方法所分析的目標(biāo)物也已經(jīng)突破了農(nóng)藥殘留的領(lǐng)域，如對重金屬、真菌毒素、環(huán)境污染物等成分的分析。對于 QuEChERS 方法來說，無水硫酸鎂、氯化鈉、醋酸鹽等鹽類成分在待檢液脫水環(huán)節(jié)中的使用十分普遍，然而，這些鹽類成分在待檢液中的殘留容易沉積在質(zhì)譜檢測器離子源表面，從而降低質(zhì)譜檢測器的信號提取性能。Gonzalez-Curbelo et al. (2014)研究利用氯化銨、醋酸銨、甲酸銨等鹽類作為鹽析主要成分，較好地解決了這個問題。該方法在煙葉農(nóng)藥殘留分析中是否同樣適用值得進(jìn)行深入研究與探討。另外，分析物保護劑(Analyte protectants, APs)已經(jīng)被用在水果(蘋果、檸檬)、蔬菜(西蘭花)及谷物(小麥)農(nóng)殘成分分析當(dāng)中(許秀麗2012；黃寶勇 2006；柴劍榮 2013)，對基質(zhì)效應(yīng)有較好的消除作用，但在煙草農(nóng)殘分析過程中還未使用。

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2.2 試驗部分
2.2.1 材料與方法
2.2.1.1 材料與試劑
所有待分析農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(共分為 10 組，每組待分析物濃度為 100μg/mL)及三苯基磷酸酯(TPP，內(nèi)標(biāo)，濃度為 20 μg/mL)購買于美國安捷倫公司，于-20 ℃冰箱中保存；敵菌丹、二溴磷以及殺線威標(biāo)準(zhǔn)品購買于德國 labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；乙腈、甲苯(HPLC 級)等有機溶劑購買于韓國 Duksan 公司；3-氧乙基 1, 2 丙二醇、谷洛糖酸內(nèi)酯、D-山梨醇以及莽草酸(純度均大于 95%)購買于美國 Sigma-Aldrich 公司；檸檬酸鈉、醋酸鈉(純度均大于 95%)購買于天津津東天正公司；甲酸銨、乙酸銨(純度均大于 95%)購買于美國 ACROS 公司；硫酸鎂購買于天津科密歐公司；50mL 離心管及鹽析包(內(nèi)含 1 g 檸檬酸鈉、0.5 g 檸檬酸氫鈉、4 g 無水硫酸鎂和 1 g 氯化鈉)試劑盒，以及2mL 離心管(內(nèi)含 150 mg 無水硫酸鎂、25 mg PSA)購買于美國安捷倫公司；空白煙葉樣品來自于國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心。
2.2.1.2 儀器與設(shè)備
GC/MS/MS(美國，安捷倫)裝置由一套氣相色譜儀(型號：7890B)以及一套三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜裝置(型號：7000C)構(gòu)成，并配置一套自動進(jìn)樣器(型號：7693)。氣相色譜儀(GC-2010 plus)，安裝 PTV 進(jìn)樣器；色譜柱采用 DB-5MS 柱(美國，安捷倫。長 30 m、內(nèi)徑 0.25 mm、膜厚 0.25 μm)；3-30K 冷凍離心機(德國，Sigma)；EOFO-945066 型多管式渦旋儀(美國，Talboys)；BSA224S-CW 電子天平 (德國，Sartorius)；Milli-Q 超純水系統(tǒng) (美國，Millipore)。
2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：從-20 ℃冰箱中取出 10 組混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，待溫度上升至常溫后，從每只混合標(biāo)液小瓶中吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL至棕色容量瓶中，用乙腈：甲苯(2:1，v:v)混合溶液定容至 10 mL，混勻后轉(zhuǎn)移至 12 mL 棕色瓶中待用。
分析物保護劑的配制：天平稱取 3-氧乙基 1, 2 丙二醇 100 mg、谷洛糖酸內(nèi)酯 10 mg、D-山梨醇 10 mg 以及莽草酸 5 mg 至 10 mL 容量瓶中，用乙腈：水(4:1，v/v)混合溶劑溶解(水的作用是促進(jìn)極性分析物保護劑溶解)。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確移取 5 μL、10 μL、25 μL 、50 μL、100 μL、250 μL、500μL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，置于 10 mL 容量瓶中，每個容量瓶中加入內(nèi)標(biāo)工作液 100 μL，用乙腈：甲苯(2:1，v/v)溶液定容，即得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，具體濃度為：1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，50 μg/L，100 μg/L，200 μg/L。

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第三章 基于在線 GPC-GC/MS/MS 的煙葉農(nóng)藥殘留分析方法建立 ................55
3.1 前言............................................................ 55
3.2 試驗部分.......................................................... 56
第四章 UPC2同時檢測溴氫菊酯和四溴菊酯研究.............................79
4.1 前言............................................................ 79
4.2 試驗部分........................................................ 80
第五章 UPC2在煙葉除草劑檢測中的應(yīng)用..................................86
5.1 前言......................................................... 86

5.2 試驗部分..................................................... 87

第五章 UPC2在煙葉除草劑檢測中的應(yīng)用

5.1 前言
除草劑是一類用于抑制雜草生長的農(nóng)用化學(xué)品，應(yīng)用除草劑可以有效增加作物產(chǎn)量，并節(jié)約勞動力(Li et al. 2011; Liao et al. 2013; Zhao et al. 2009)。由于具有高殘留毒性及其超量使用問題，除草劑已經(jīng)開始被廣泛關(guān)注(Liao et al. 2013)。由于煙葉具有較大的比表面積，與其他作物相比，煙葉具有更加嚴(yán)重的殘留風(fēng)險(Ferris et al. 2011)。除草劑屬于內(nèi)吸性農(nóng)藥，一旦與人體接觸，其很容易被皮膚及衣物等吸收，從而導(dǎo)致持久及重復(fù)地暴露問題(Li et al. 2011)。而且，在煙葉的后期加工過程中，除草劑并不能夠被完全去除。這樣，此類化合物就會很容易進(jìn)入吸煙者及其周圍人體內(nèi)，進(jìn)而增加健康危害(CORESTA2013)。國際煙草科學(xué)合作組織已經(jīng)分別對敵草胺，甲草胺，精喹禾靈，雙苯酰草胺，異丙甲草胺及異噁草酮等 6 種除草劑的最大殘留量進(jìn)行了限定，具體為 0.1 mg/kg，0.1mg/kg，0.2 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.2 mg/kg (Yang et al. 2013)。因此，煙葉中除草劑的衡量測定及監(jiān)控方法的發(fā)展與建立是非常重要的。
為減少除草劑對人體的危害性，目前，許多可靠的檢測方法如氣相色譜(Liao et al.2013; Zhao et al. 2009)及液相色譜(Zhang et al. 2011)等被建立并用于實際樣品的分析。而且，多種檢測器如電子捕獲檢測器(ECD)、火焰光度檢測器 (FPD) (Zhao et al. 2008)、二極管陣列檢測器(PDA) (Rahman et al. 2012)以及單級及串聯(lián)質(zhì)譜(MS、MS/MS)(Ferris etal. 2011; Lan et al. 2014)被安裝至色譜儀以獲得較好的儀器分析效果。盡管這些檢測器具有較好的選擇性或靈敏度，要想獲得可靠的分析結(jié)果，良好的分離效果依然是十分重要的(Chen et al. 2013)。每種分離方法均有其優(yōu)缺點。例如，氣相色譜儀具有較好的選擇性和靈敏度(Novakova et al. 2014)，但是由于運行溫度往往處在較高的水平(一般為 90 ℃-300 ℃)，而且運行的時間較長。有研究采用氣相色譜分析 5 種除草劑，儀器分析時間為 27 min (Mayer et al. 2009)。液相色譜也具有一些缺點，例如，液相色譜一般需要較大體積的有機溶劑或化學(xué)試劑作為流動相。因此，采用更加簡便、省時及綠色環(huán)保的分析方法依然是煙草除草劑超靈敏檢測的研究應(yīng)用方向。

圖 5-1 展示了 6 種目標(biāo)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式，其中大多數(shù)具有相似的酰胺類結(jié)構(gòu)和相近的官能團。本章將重點研究及優(yōu)化 UPC2參數(shù)對 6 種目標(biāo)物質(zhì)的影響，并對前處理過程進(jìn)行研究。從而實現(xiàn)對煙草中 6 種除草劑的 UPC2同時分析。

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第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點與展望

煙草中農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)越來越受到消費者和相關(guān)的管理部門及生產(chǎn)企業(yè)的重視。本文的目的是研究更加快速、高效、高通量，具有較高靈敏度及選擇性，分析過程更加穩(wěn)定，分析結(jié)果可靠的檢測方法，并將其應(yīng)用在煙草農(nóng)殘的實際檢測當(dāng)中。內(nèi)容主要包括以下三個方面：首先，研發(fā)了以銨鹽作為鹽析試劑的煙葉樣品預(yù)處理技術(shù)，采用分析物保護劑進(jìn)行 GC-MS/MS 分析，建立了煙草中農(nóng)藥多殘留的分析方法，提高了常規(guī) GC-MS/MS 法對煙葉中農(nóng)藥多殘留分析結(jié)果的檢測可靠性；其次，建立了煙葉中農(nóng)藥多殘留分析的在線 GPC-GC-MS/MS 分析方法，探索了樣品提取試劑、凈化模式等樣品前處理模式對檢測結(jié)果的影響，對 GPC 的基本參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終獲得了較好的分析效果；最后，研究了煙草中除草劑及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的 UPC2多農(nóng)殘檢測方法，對 6 種除草劑及 2 種擬除蟲菊酯的 UPC2參數(shù)、提取劑凈化過程進(jìn)行優(yōu)化，實現(xiàn)了各種目標(biāo)物質(zhì)的高效分離檢測。以下為本研究的主要結(jié)論、創(chuàng)新點。同時，對相關(guān)研究的發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

6.1 結(jié)論
6.1.1 煙葉銨鹽鹽析預(yù)處理技術(shù)及分析物保護劑在GC-MS/MS農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用

研發(fā)以銨鹽作為鹽析試劑的煙葉樣品預(yù)處理技術(shù)，并采用分析物保護劑進(jìn)行GC-MS/MS 分析，獲得以下結(jié)果：(1)通過改變前處理過程中的鹽析試劑，利用熔點和沸點均低于質(zhì)譜運行溫度的甲酸銨作為鹽析試劑，有效減少殘留鹽份在離子源表面形成沉淀的問題，延長了離子源維護后的正常運行時間；(2)通過采用分析物保護劑(3-氧乙基 1, 2 丙二醇、古洛糖酸內(nèi)酯、D-山梨醇以及莽草酸等)與煙葉基質(zhì)共同配標(biāo)，有效保證了分析目標(biāo)物在儀器分析過程中的響應(yīng)值，分析結(jié)果更加可靠。經(jīng)過研究，本方法能夠?qū)熑~中 150 種農(nóng)藥殘留成分進(jìn)行檢驗，所分析的大部分農(nóng)殘目標(biāo)物回收率在70%-120%范圍，日內(nèi)精密度及日間精密度理想。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：128485