第一章緒論

多細(xì)胞生物是指由兩個(gè)或兩個(gè)以上分化細(xì)胞構(gòu)成的生物體,如植物、動(dòng)物、藻類(lèi)和真菌都是多細(xì)胞生物。關(guān)于多細(xì)胞生物如何產(chǎn)生有著種種假說(shuō)。共生理論(Symbiosistheory)認(rèn)為多細(xì)胞生物是由多種不同功能的單細(xì)胞生物聚集之后偶然完成了生理協(xié)作而成,主要立足于對(duì)多細(xì)胞生物各功能分化部分的解釋,但存在一系列的遺傳學(xué)問(wèn)題難以解決。群體學(xué)說(shuō)(Colonialtheory)則認(rèn)為多細(xì)胞生物先是由多個(gè)單細(xì)胞的同種生物聚集起來(lái),或是單個(gè)細(xì)胞多次分裂后無(wú)法相互分離而聚集,之后細(xì)胞群體產(chǎn)生分化逐漸形成多細(xì)胞生物。以上假設(shè)都相對(duì)籠統(tǒng),這一問(wèn)題確實(shí)尚無(wú)定論,下面從幾個(gè)方面展開(kāi)討論。首先,多細(xì)胞生物的第一持征并非是細(xì)胞聚集體,而是個(gè)體內(nèi)部各個(gè)部分的高度分化和分工,任何單一部分都無(wú)法獨(dú)立地完成對(duì)整體的重建。從這一點(diǎn)上可區(qū)分腫瘤及細(xì)菌生物膜與多細(xì)胞生物,因?yàn)槟[瘤和生物膜的組成單元雖然可能由于所處相對(duì)位置不同而代謝活性有所區(qū)別,但單一的細(xì)胞個(gè)體取出后仍然可以生成新的腫瘤和生物膜,因此癌細(xì)胞和細(xì)菌都并非具有高度分化能力的個(gè)體,癌細(xì)胞是喪失了分化能力的細(xì)胞。第二,既然分化性對(duì)于多細(xì)胞生物如此重要,又從一般演化理論上說(shuō)"存在即有優(yōu)勢(shì)",那么分化的優(yōu)勢(shì)是什么呢?這點(diǎn)可從人類(lèi)社會(huì)分工的過(guò)程來(lái)理解。起初由于生產(chǎn)資料有限,人們靠打獵維持生活,人人只需要學(xué)會(huì)打獵。隨著生產(chǎn)力的發(fā)展,各種生產(chǎn)方式如種植、畜牧、冶金相繼出現(xiàn),而商品交換直接推動(dòng)了社會(huì)分工。大家為什么不去努為成為全才,把所有技能都學(xué)會(huì)呢?一是個(gè)體精力有限,很難學(xué)會(huì)所有的技能;二是就算學(xué)會(huì)的所有的技能也無(wú)法全部使用這些技能,因?yàn)槊糠N技能都對(duì)應(yīng)著一種生產(chǎn)工具,人們必須首先制備這些生產(chǎn)工具才能完成生產(chǎn),存在很大的成本問(wèn)題。

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第二章細(xì)菌譜行運(yùn)動(dòng)的高通量分析

2.1本章概述

早期,人們把細(xì)苗戳到瓊脂板的底部,認(rèn)為這種條件下細(xì)菌無(wú)法游動(dòng),只能依靠菌完成蹭行(圖11(a))。由于拍照技術(shù)的限制,研究者只能得到畫(huà)質(zhì)較低的照片,通過(guò)測(cè)量細(xì)菌群落邊界的大小來(lái)描述蹭行能為。近年來(lái)顯微照相技術(shù)、在線細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展使得對(duì)蹲行的原位觀測(cè)成為可能,Gibiansky和Jin等人在高速顯微鏡下觀察祿旅桿菌的蹭行過(guò)程,同時(shí)引入圖像追蹤算法對(duì)蹭行的行走和跳躍兩種亞型進(jìn)行了定量描述。Zhang等人在不同高度的高分子刷表面觀察蹭行過(guò)程,發(fā)現(xiàn)高粘度表面跳躍頻率明顯升高[172]。然而,以上的觀測(cè)都是針對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)局部性質(zhì)的研究,欲理解蹭行的宏觀規(guī)律需首先對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和定量分析。我們據(jù)此引入了一套自動(dòng)化、圖形化輸出的蹭行分析方法,系統(tǒng)地描述細(xì)菌蹭行過(guò)程中運(yùn)動(dòng)速度、運(yùn)動(dòng)軌跡和轉(zhuǎn)動(dòng)情況,同時(shí)改變往的實(shí)驗(yàn)方以實(shí)現(xiàn)大量運(yùn)動(dòng)信息的高效采集,從而最終完成對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的宏觀統(tǒng)計(jì)描述。本章將從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、蹲行視頻采集、圖像處理以及數(shù)據(jù)匯總分析和輸出等方面詳細(xì)闡述該一方法。

2.2綠賊桿菌在表面上蹭行運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)的高通量獲取

2.2.1細(xì)菌培養(yǎng)
我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中使用的菌種為綠旅桿菌ATCC15692 fliM基因是為了消除細(xì)菌鞭毛對(duì)蹭行運(yùn)動(dòng)的干擾。首先從-80°C冰箱中取出凍存的菌種,在1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)板上劃線,放在恒溫培養(yǎng)箱中37°C解育18小時(shí)。待長(zhǎng)出菌斑后,挑一個(gè)單克隆菌斑接種于1ml限制性培養(yǎng)基FAB+30mM谷氨酸,在37。200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u菌培養(yǎng)10小時(shí)。在對(duì)數(shù)期約00600 0.8左右收集細(xì)菌,按體積比1:1稀釋到1ml新鮮的FAB中。

第三章細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)的多樣性及環(huán)境響應(yīng)性......79

3.1本章概述......79
3.2細(xì)菌蹭行運(yùn)動(dòng)的多樣性及分類(lèi)......79
3.3不同養(yǎng)料環(huán)境對(duì)細(xì)菌表面爬行行為的影響......85
第四章蹲行運(yùn)動(dòng)模型的建立及模擬......99
4.1本章概述......99
4.2運(yùn)動(dòng)模型的建立......99
4.3運(yùn)動(dòng)模型的計(jì)算機(jī)模擬......103
第五章銅綠假單胞菌表面感知機(jī)制的研究......117
5.1本章概述......117
5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果......119
5.3實(shí)驗(yàn)方法和步驟........126

第四章蹭行運(yùn)動(dòng)模型的建立及模擬

4.1本章概述

從第三章可知,在蹭行運(yùn)動(dòng)過(guò)程中細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)速度和軌跡的平滑程度呈明顯的正相關(guān),而且貫穿始終的多樣性是該過(guò)程最為明確不可回避的特征。怎樣理解和解釋這種正相關(guān)性以及多樣性成為理解蹭行運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵,本章將圍繞這一問(wèn)題做仔細(xì)的探討。我們首先嘗試建立一個(gè)基于細(xì)菌胞內(nèi)FimX蛋白分布的理論運(yùn)動(dòng)模型,闡述細(xì)菌運(yùn)動(dòng)速度和軌跡形狀的關(guān)聯(lián)性以及多樣化運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的分子內(nèi)因。該模型假設(shè)分布于細(xì)菌兩極的菌毛相互競(jìng)爭(zhēng)地將細(xì)茵拉向相反方向,而FimX的布決定兩極菌毛的活躍程度。我們從已有的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)中抽提出菌毛動(dòng)作的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),再按照蒙恃卡洛抽樣模式的方法模式細(xì)菌在表面上的運(yùn)動(dòng),通過(guò)對(duì)FimX表達(dá)量參數(shù)7和對(duì)稱(chēng)性參數(shù)片的調(diào)節(jié),完全重現(xiàn)了細(xì)菌的多樣性蹭行過(guò)程。然后,我們從保險(xiǎn)假設(shè)的角度去理解蹭行運(yùn)動(dòng)保持多樣性的演化內(nèi)因。我們假設(shè)蹭行運(yùn)動(dòng)具有尋找資源和聚集成巧的兩相功能,運(yùn)動(dòng)快的細(xì)菌在尋找新的資源、占有新的領(lǐng)地方面擁有優(yōu)勢(shì),而運(yùn)動(dòng)慢的細(xì)菌更能在一個(gè)生長(zhǎng)條件比較優(yōu)越的環(huán)境中聚集,進(jìn)而成為生命力更強(qiáng)的生物膜形式的存在。這樣,多樣性的運(yùn)動(dòng)提供了一個(gè)雙保險(xiǎn),使細(xì)菌在漫長(zhǎng)的演化史上很好地適應(yīng)快速變化的外界環(huán)境。最后,我們?nèi)匀煌ㄟ^(guò)計(jì)算機(jī)模擬的方法,解析出不同7和片情況下細(xì)菌搜素養(yǎng)料和形成聚集體的能力,驗(yàn)證保險(xiǎn)假設(shè)的猜想。

4.2運(yùn)動(dòng)模型的建立

銅綠假單胞菌單個(gè)細(xì)菌也包含多根菌毛,不同于淋球菌的是綠銅綠假單胞菌為長(zhǎng)圓形,其菌毛并非周身分布,而是位于長(zhǎng)軸的兩端且均可拉動(dòng)細(xì)菌。在菌毛的后方有兩個(gè)極為關(guān)鍵的馬達(dá), PilB使菌毛蛋白單元PilA聚合伸出胞外,而PilT則將PilA解聚合使菌毛收縮。N1T和PilB均為ATP水解酶,通過(guò)消耗ATP得到能量,然后供給細(xì)菌運(yùn)動(dòng)。在PilB的后方則有PilZ和FimX,調(diào)節(jié)PilB的功能,第三章中已經(jīng)證實(shí)FimX的胞內(nèi)分布決定著蹭行運(yùn)動(dòng)的方向。

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第五章銅綠假單胞菌表面感知機(jī)制的研究

5.1本章概述

第一章中己經(jīng)介紹,研究細(xì)菌的表面感知機(jī)制即是研究細(xì)菌梢附到表面后如何完成表型轉(zhuǎn)變,從活躍游動(dòng)的浮游狀態(tài)變?yōu)樯锬さ臓钪尽；蛟S有人認(rèn)為表面感知或浮游態(tài)-表面態(tài)轉(zhuǎn)變是一個(gè)偽命題,細(xì)菌粘附表面之后只是自然地生長(zhǎng)、増多,最后堆在一起而己。然而,多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明生物膜內(nèi)細(xì)菌的表型確己發(fā)生明顯改變。例如以hiteky等人用微陣列方法測(cè)量銅緑假單胞菌生物膜內(nèi)部基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),雖然絕大多數(shù)基因表達(dá)水平基本不變,但有約1%的基因表達(dá)明顯上升或下降;生物膜中的胞外聚合物干重所占比例通常很高,可見(jiàn)生物膜中細(xì)菌分泌多糖、胞外蛋白等的能力也強(qiáng)于浮游態(tài)細(xì)菌。那么,浮游態(tài)-表面態(tài)轉(zhuǎn)變的具體過(guò)程是什么?這一問(wèn)題包括兩點(diǎn):一是細(xì)菌通過(guò)哪套系統(tǒng)響應(yīng)了哪種表面信號(hào)?二是響應(yīng)外界信號(hào)后細(xì)菌經(jīng)歷哪種信號(hào)通路調(diào)節(jié)表型的轉(zhuǎn)變?

5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Christen等在實(shí)驗(yàn)中將sensor克隆在質(zhì)粒上并以tac啟動(dòng)子控制sensor的轉(zhuǎn)錄,在iptg誘導(dǎo)條件下觀察FRET信號(hào)。以上方法在長(zhǎng)時(shí)間的生物膜跟蹤檢測(cè)中遇到兩個(gè)問(wèn)題:一是中等濃度iptg誘導(dǎo)下各細(xì)菌之間sensor表達(dá)量不均勻,表達(dá)量太低的細(xì)菌數(shù)據(jù)分析噪音較大;二是質(zhì)粒在細(xì)菌中的拷貝數(shù)不穩(wěn)定,必須始終保持抗生素張力環(huán)境才能防止質(zhì)粒丟失,而我們則希望盡量避免引入額外的條件。我們首先利用miniTn基因重組系統(tǒng)將sensor基因片段重組到銅綠假單胞菌基因組上的固定位置,并分別嘗試用結(jié)構(gòu)性后動(dòng)子如lac、tac、PA10403以及人工合成的結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子等控制sensor基因的轉(zhuǎn)錄,以此實(shí)現(xiàn)將sensor基因在細(xì)菌中以單拷貝的方式穩(wěn)定表達(dá)。如圖5.3所示為各啟動(dòng)子下sensor在細(xì)菌中表達(dá)的英光信號(hào)我們最終選擇信噪比較好的PA10403-sensor系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

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參考文獻(xiàn)（略)

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本文編號(hào)：150071