發(fā)布時間：2017-09-27 11:34

  本文關鍵詞：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌體免疫納米抗體庫構建及抗Cap納米抗體的篩選

  更多相關文章： 豬圓環(huán)病毒II型(PCV2) 噬菌體展示抗體庫 納米抗體(VHH) Cap

【摘要】：豬圓環(huán)病毒II型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起PCV2相關疾病(PCV2-associated diseases,PCVAD)的主要病原。PCVAD目前呈世界范圍內(nèi)廣泛流行,給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失。PCV2為單股環(huán)狀負鏈DNA病毒,也是目前已知最小動物病毒,Cap蛋白為PCV2唯一結(jié)構蛋白,同時也是臨床上PCVAD預防和診斷的主要靶標。PCV2的快速檢測是預防PCVAD的重要手段之一。為建立快速有效的PCV2血清學檢測方法,本研究以商品化PCV2亞單位疫苗為免疫原免疫雙峰駝,構建駱駝重鏈可變區(qū)抗體(Single-domain variable heavy chain antibody,VHH or nanobodies)噬菌體免疫庫。以原核表達的PCV2 Cap病毒樣顆粒(viral like particles,VLPs)為抗原,生物淘洗篩選針對PCV2 Cap的VHHs,為PCV2抗原檢測提供高質(zhì)量抗體。本研究內(nèi)容分為3部分:1.篩選用抗原制備構建表達Cap蛋白的重組表達質(zhì)粒pET32a-SUMO-Cap。轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3),誘導表達并純化重組Cap蛋白,經(jīng)SUMO蛋白酶Ulp酶切裂解和Ni2+親和樹脂純化后獲得無任何多余氨基酸的Cap蛋白。進一步經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),無多余氨基酸的PCV2Cap蛋白能在體外自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)。2.構建文庫用噬菌粒的改造以商品化噬菌粒pCANTAB5E為載體骨架,通過Linker引入,將pCANTAB5E載體上用于VHH文庫插入的Sfi I、Not I雙酶切位點變成兩個識別序列不同的Sfi I酶切位點。在兩個Sfi I酶切位點之間進一步引入CAT/Ccdb正負篩選標簽。獲得構建VHH文庫用噬菌粒pCANTAB5E-Ccdb-cm�？寺⌒蕶z測結(jié)果發(fā)現(xiàn),改造后的pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒與商品化噬菌粒pCANTAB5E相比,顯著提高了VHH的克隆效率。3.利用PCV2商品化亞單位疫苗免疫雙峰駝,免疫5次后,分離外周血淋巴細胞,提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后,兩步法擴增獲得VHH庫。將擴增的VHH庫與pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒經(jīng)Sfi I酶切后,連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞,成功構建了可用于Cap蛋白VHH淘篩的VHH噬菌體初級庫(庫容6×106,插入率100%,多樣性豐富)。以Cap VLPs為淘篩抗原,通過4輪淘篩和phage-ELISA檢測,獲得了4株反應性較好的VHHs。本研究構建了PCV2噬菌體免疫納米抗體庫,并篩選到了4株具有抗Cap活性的VHHs,為以VHH抗體為基礎的PCV2抗原檢測試劑盒研發(fā)和PCV2致病機理研究奠定了基礎。
【關鍵詞】：豬圓環(huán)病毒II型(PCV2) 噬菌體展示抗體庫 納米抗體(VHH) Cap
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻綜述13-27
• 1.1 噬菌體展示技術研究進展13-19
• 1.1.1 絲狀噬菌體結(jié)構和生活史13-15
• 1.1.2 噬菌體文庫的構建15-16
• 1.1.3 淘篩16-17
• 1.1.4 噬菌體展示技術的發(fā)展現(xiàn)狀17-19
• 1.2 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）研究概況19-24
• 1.2.1 PCV2遺傳型和抗性19-20
• 1.2.2 易感類群和傳播途徑20
• 1.2.3 病毒生活史及致病機制20
• 1.2.4 PCVAD20-21
• 1.2.5 PCV2衣殼蛋白Cap21-22
• 1.2.6 目前可以使用的商業(yè)化疫苗22-23
• 1.2.7 試驗性PCV2疫苗23-24
• 1.2.8 病毒樣顆粒（VLP）疫苗24
• 1.3 納米抗體及其在診斷上的應用24-26
• 1.4 本研究的目的和意義26-27
• 試驗研究27-61
• 第二章 噬菌粒載體的改造及Cap的病毒樣顆粒的制備27-46
• 2.1 試驗材料27-28
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒27
• 2.1.2 主要試劑及儀器27
• 2.1.3 主要溶液27-28
• 2.1.4 引物設計與合成28
• 2.2 方法28-36
• 2.2.1 pCANTAB5E-linker載體的構建28-30
• 2.2.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm載體的構建30-32
• 2.2.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比較32
• 2.2.4 pET32a-SUMO-Cap表達載體的構建32-33
• 2.2.5 重組Cap蛋白的誘導表達33
• 2.2.6 重組Cap蛋白的大量表達與純化33-34
• 2.2.7 SUMO蛋白酶Ulp的表達與純化34-35
• 2.2.8 His-SUMO-Cap融合蛋白的酶切與純化35
• 2.2.9 Cap的病毒樣顆粒的鑒定35-36
• 2.3 結(jié)果與分析36-44
• 2.3.1 pCANTAB5E-linker載體的構建36-38
• 2.3.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm載體的構建38-39
• 2.3.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比較39-41
• 2.3.4 重組Cap蛋白的誘導表達41
• 2.3.5 重組Cap蛋白的純化與濃縮41-42
• 2.3.6 SUMO蛋白酶Ulp的表達與純化42-43
• 2.3.7 His-SUMO標簽的去除及酶切純化43
• 2.3.8 Cap蛋白的Western Blotting分析43-44
• 2.3.9 VLPs形成的鑒定44
• 2.4 討論44-45
• 2.5 小結(jié)45-46
• 第三章 噬菌體展示抗體庫的構建和特異性抗體的篩選46-61
• 3.1 試驗材料46
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒46
• 3.1.2 試驗動物及疫苗46
• 3.1.3 主要試劑46
• 3.1.4 主要儀器設備46
• 3.1.5 主要培養(yǎng)基的配置46
• 3.2 方法46-54
• 3.2.1 動物免疫46-47
• 3.2.2 淋巴細胞的分離47
• 3.2.3 淋巴細胞總RNA的提取47
• 3.2.4 VHH片段的擴增47-48
• 3.2.5 載體和VHH片段的兩步酶切48-49
• 3.2.6 VHH抗體庫的構建及鑒定49-52
• 3.2.7 特異性抗體的淘選52-53
• 3.2.8 Phage ELISA鑒定抗原陽性重組抗體53-54
• 3.3 結(jié)果與分析54-59
• 3.3.1 淋巴細胞分離與RNA提取54-55
• 3.3.2 VHH基因的擴增55
• 3.3.3 載體和VHH片段的兩步酶切55-56
• 3.3.4 抗體庫的構建和插入率檢測56-57
• 3.3.5 抗體庫的豐度和多樣性鑒定57-58
• 3.3.6 抗體庫的淘選58-59
• 3.4 討論59
• 3.5 小結(jié)59-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻62-72
• 附錄72-76
• 致謝76-77
• 作者簡介77

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