本文關(guān)鍵詞：小菜蛾過氧化物還原酶基因的鑒定及其功能研究

  更多相關(guān)文章： 小菜蛾 過氧化物還原酶 氧化壓力 熒光定量PCR RNA干擾

【摘要】：過氧化物還原酶(Peroxiredoxins,Prxs)是廣泛存在于真核生物和原核生物中的一個(gè)過氧化物酶超家族,其抗氧化作用對(duì)生物體是至關(guān)重要的。有關(guān)昆蟲的Prx基因已有報(bào)道,但是小菜蛾的Prx基因家族還沒有完整的研究報(bào)道。本研究克隆了小菜蛾的4個(gè)過氧化物還原酶基因分別為PxPrx1、PxPrx3、 PxPrx5、PxPrx6,其中PxPrx1、PxPrx3屬于典型的2-Cys Prxs；PxPrx5屬于非典型的2-Cys Prxs；PxPrx6屬于1-Cys Prxs。進(jìn)化樹分析表明這4個(gè)基因與其他昆蟲的Prx基因親緣關(guān)系密切。本研究使用熒光定量PCR分析了PxPrx1、PxPrx3、PxPrx5和PxPrx6在小菜蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)水平,結(jié)果表明PxPrx1和Px Prx5均在蛹期和成蟲期高表達(dá)：PxPrx3在幼蟲期和成蟲期高表達(dá),而在蛹期低表達(dá)；PxPrx6在成蟲期高表達(dá)。比較小菜蛾敏感品系、毒死蜱抗性品系和氟蟲腈抗性品系3齡幼蟲中4個(gè)Prx基因的表達(dá)量,除了PxPrx1在2個(gè)抗性品系中高表達(dá)外,其他3個(gè)基因并沒有顯著的差異性表達(dá)。比較小菜蛾馬氏管、中腸、頭部、表皮以及脂肪體中Prxs基因的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)PxPrx1、PxPrx6和PxPrx5在馬氏管表達(dá)量高,PxPrx3在5個(gè)組織中的表達(dá)量無明顯差異。比較4個(gè)Prx基因在小菜蛾齡期以及組織中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)PxPrx6的表達(dá)量遠(yuǎn)低于其他3個(gè)基因,而其余3個(gè)基因的總體表達(dá)量相近。本研究還進(jìn)行了小菜蛾冷、熱、紫外(UV)照射、過氧化氫以及殺蟲劑處理后,4個(gè)Prx基因的表達(dá)變化。選取特異性表達(dá)的基因PxPrx3和PxPrx5進(jìn)行RNA干擾,結(jié)果表明基因的表達(dá)在24 h受到明顯的抑制。用UV處理小菜蛾2h后,注射dsGFP組的PxPrx3的表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組和注射dsPxPrx3組;用熱處理小菜蛾2h后,注射寸dsPxPrx3組的PxPrx3的表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組和注射dsGFP組。用UV處理小菜蛾2h后,注射dsGFP組的PxPrx5的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組；用熱處理小菜蛾2h后,注射dsGFP組的PxPrx5的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。由此可見,PxPrxs能夠在一定程度上保護(hù)小菜蛾免受氧化損傷,但PxPrxs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平是多樣的,取決于PxPrx s的類型和壓力的強(qiáng)度。
【關(guān)鍵詞】：小菜蛾 過氧化物還原酶 氧化壓力 熒光定量PCR RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S433.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 1 前言12-18
• 1.1 小菜蛾的危害性12
• 1.2 過氧化物還原酶的發(fā)現(xiàn)與分類12-14
• 1.3 過氧化物還原酶的抗氧化機(jī)制14-15
• 1.4 昆蟲中過氧化物還原酶序列的特性15-16
• 1.5 昆蟲過氧化物還原酶基因的功能研究16-18
• 1.5.1 過氧化物還原酶存在的部位及其角色16-17
• 1.5.2 過氧化物還原酶基因的應(yīng)激表達(dá)17-18
• 2 材料與方法18-28
• 2.1 供試蟲源18
• 2.2 主要試劑18
• 2.3 主要儀器18-19
• 2.4 試驗(yàn)方法19-20
• 2.4.1 小菜蛾總RNA的提取19-20
• 2.4.2 合成cDNA20
• 2.5 PCR產(chǎn)物回收、克隆與測(cè)序20-23
• 2.5.1 PCR及產(chǎn)物回收20-22
• 2.5.2 目的片段與T載體連接與轉(zhuǎn)化22-23
• 2.5.2.1 制備感受態(tài)細(xì)胞22
• 2.5.2.2 連接和轉(zhuǎn)化22-23
• 2.6 小菜蛾與其他昆蟲的過氧化物還原酶進(jìn)化樹分析23-24
• 2.7 小菜蛾過氧化物還原酶基因的表達(dá)譜分析24
• 2.8 不同發(fā)育階段、組織及不同脅迫下小菜蛾過氧化物還原酶基因的表達(dá)量測(cè)定24-26
• 2.8.1 小菜蛾不同齡期樣品收集24
• 2.8.2 小菜蛾不同組織樣品收集24
• 2.8.3 不同環(huán)境因子脅迫下小菜蛾過氧化物還原酶基因應(yīng)激表達(dá)量的測(cè)定24-26
• 2.8.3.1 溫度處理24-25
• 2.8.3.2 紫外線(UV)照射處理25
• 2.8.3.3 過氧化氫(H_2O_2)處理25
• 2.8.3.4 殺蟲劑處理25-26
• 2.9 挑選特異性表達(dá)的小菜蛾過氧化物還原酶基因進(jìn)行RNA干擾26-27
• 2.10 熒光定量PCR測(cè)定小菜蛾過氧化物還原酶基因相對(duì)的表達(dá)量27
• 2.11 數(shù)據(jù)分析27-28
• 3 結(jié)果與分析28-45
• 3.1 小菜蛾過氧化物還原酶基因全長cDNA的克隆與分析28-32
• 3.1.1 PxPrx1全長cDNA的克隆28-29
• 3.1.2 PxPrx3全長cDNA的克隆29-30
• 3.1.3 PxPrx5全長cDNA的克隆30-31
• 3.1.4 PxPrx6全長cDNA的克隆31-32
• 3.2 小菜蛾與其他昆蟲過氧化物還原酶的同源性分析32-34
• 3.3 小菜蛾過氧化物還原酶基因的表達(dá)譜分析34-35
• 3.4 小菜蛾過氧化物還原酶基因在不同發(fā)育階段、不同品系的表達(dá)量分析35-36
• 3.5 小菜蛾過氧化物還原酶基因在不同組織的表達(dá)量分析36-37
• 3.6 不同環(huán)境因子脅迫下小菜蛾過氧化物還原酶基因應(yīng)激表達(dá)量的測(cè)定37-43
• 3.6.1 溫度處理37-40
• 3.6.1.1 冷處理37-38
• 3.6.1.2 室溫(25℃)對(duì)照組38-39
• 3.6.1.3 熱處理39-40
• 3.6.2 紫外(UV)照射處理40-41
• 3.6.3 過氧化氫(H_2O_2)處理41-42
• 3.6.4 殺蟲劑處理42-43
• 3.7 RNA干擾后小菜蛾過氧化物還原酶基因表達(dá)變化43-45
• 3.7.1 RNA干擾PxPrx343-44
• 3.7.2 RNA干擾PxPrx544-45
• 4 總結(jié)與討論45-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 附錄 基因克隆中PCR反應(yīng)條件53-54
• 致謝54

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