本文關(guān)鍵詞：七鰓鰻PHB2增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受的作用及機(jī)制初探

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【摘要】：七鰓鰻是我國(guó)東北部特有的魚形動(dòng)物,是連接無脊椎與脊椎動(dòng)物的橋梁。PHB蛋白廣泛分布于多種生物細(xì)胞中,主要以異源二聚體的形式錨定在線粒體內(nèi)膜,動(dòng)態(tài)維持線粒體結(jié)構(gòu)及功能的穩(wěn)定。當(dāng)線粒體氧化呼吸鏈功能異常,氧自由基過量積累,極易形成氧化應(yīng)激,它是引起神經(jīng)退行性疾病、腫瘤及諸多慢性病癥的重要原因。基于PHB動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)線粒體功能穩(wěn)定與細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)緊密相關(guān),PHB正逐步成為研究多種細(xì)胞增強(qiáng)氧化應(yīng)激耐受作用的熱點(diǎn)蛋白。然而PHB家族之一的PHB2與處于氧化應(yīng)激環(huán)境中七鰓鰻適應(yīng)性的關(guān)系,目前尚無人研究。本論文以七鰓鰻PHB2蛋白在組織、細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用和機(jī)制為著眼點(diǎn)開展研究,有助于七鰓鰻PHB2蛋白功能的揭示,為闡述人PHB2在氧化應(yīng)激中作用機(jī)制的演化提供了線索。本研究利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了七鰓鰻Lm-PHB2蛋白在鰓和腎細(xì)胞中的定位,利用阿霉素注射和H2O2刺激的方法分別構(gòu)建七鰓鰻氧化應(yīng)激動(dòng)物模型和人正常細(xì)胞的氧化應(yīng)激模型,通過QPCR和Western blot的方法檢測(cè)了Lm-PHB2在氧化應(yīng)激刺激前后各組織中的分布和表達(dá),通過外加蛋白孵育細(xì)胞和構(gòu)建真核表達(dá)載體及細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),利用MTT法分析了重組蛋白rLm-PHB2和真核表達(dá)蛋白Lm-PHB2在人張氏肝細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了氧化應(yīng)激條件下Lm-PHB2在人張氏肝細(xì)胞中的定位遷移,利用QPCR法分析了氧化應(yīng)激條件下Lm-PHB2與VDAC3和TP53之間的表達(dá)關(guān)系。結(jié)果表明,Lm-PHB2主要定位在線粒體和細(xì)胞核;Lm-PHB2在七鰓鰻的主要組織中均有表達(dá),且它的表達(dá)與組織細(xì)胞的氧化應(yīng)激密切相關(guān);rLm-PHB2能夠增加人張氏肝細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激耐受性;Lm-PHB2增強(qiáng)張氏肝細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受性與其從細(xì)胞核向線粒體的定位遷移緊密相關(guān);氧化應(yīng)激條件下Lm-PHB2與VDAC3和TP53在不同組織中表現(xiàn)出不同的表達(dá)關(guān)系。綜上,七鰓鰻Lm-PHB2能夠增強(qiáng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激耐受性,在人張氏肝細(xì)胞中很可能是通過蛋白的定位遷移實(shí)現(xiàn)的,而在七鰓鰻的組織細(xì)胞中可能是利用與VDAC3和TP53的相互作用,通過多條信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激耐受性。
【關(guān)鍵詞】：七鰓鰻 PHB2 氧化應(yīng)激 耐受性增強(qiáng) 機(jī)制初探
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第1章 緒論9-18
• 1.1 七鰓鰻研究進(jìn)展及其特殊地位9-10
• 1.1.1 東北七鰓鰻概況9
• 1.1.2 七鰓鰻研究進(jìn)展9-10
• 1.1.3 七鰓鰻的研究?jī)r(jià)值10
• 1.2 PHB研究進(jìn)展10-15
• 1.2.1 PHB的結(jié)構(gòu)10
• 1.2.2 PHB的定位10-11
• 1.2.3 PHB的功能11-15
• 1.2.3.1 PHB在細(xì)胞核中的功能11-13
• 1.2.3.2 PHB在線粒體中的功能13-14
• 1.2.3.3 PHB在氧化應(yīng)激中的作用14-15
• 1.3 氧化應(yīng)激15-17
• 1.3.1 活性氧及氧化應(yīng)激15
• 1.3.2 活性氧的生理功能15-16
• 1.3.3 活性氧對(duì)機(jī)體的損傷16
• 1.3.4 氧化應(yīng)激的研究意義16-17
• 1.4 本論文的研究目的和意義17-18
• 第2章 phb2在七鰓鰻各組織中的表達(dá)18-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-23
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與設(shè)備18-19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 2.1.2.1 免疫熒光檢測(cè)Lm-PHB2蛋白的亞細(xì)胞定位19
• 2.1.2.2 阿霉素免疫東北七鰓鰻及組織分離19
• 2.1.2.3 Total RNA提取19-20
• 2.1.2.4 RNA反轉(zhuǎn)錄20-21
• 2.1.2.5 RT-PCR及QPCR檢測(cè)phb2在各組織中的表達(dá)21-22
• 2.1.2.6 Western Blot檢測(cè)PHB2在各組織中的表達(dá)22-23
• 2.2 結(jié)果23-29
• 2.2.1 七鰓鰻Lm-PHB2蛋白的亞細(xì)胞定位23-25
• 2.2.2 RNA提取結(jié)果25
• 2.2.3 氧化應(yīng)激模型構(gòu)建25-26
• 2.2.4 phb2在七鰓鰻各組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量26-28
• 2.2.5 PHB2在七鰓鰻各組織中的蛋白表達(dá)量28-29
• 2.3 討論29-30
• 2.4 小結(jié)30-31
• 第3章 rpEGFP-N1-Lm-phb2真核表達(dá)載體的構(gòu)建31-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法31-37
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與設(shè)備31-32
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法32-37
• 3.1.2.1 七鰓鰻phb2基因引物設(shè)計(jì)32
• 3.1.2.2 七鰓鰻phb2基因擴(kuò)增32-33
• 3.1.2.3 目的片段phb2的回收33-34
• 3.1.2.4 七鰓鰻phb2基因真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建34-35
• 3.1.2.5 質(zhì)粒提取、鑒定及去內(nèi)毒素35-36
• 3.1.2.6 張氏肝細(xì)胞(Chang liver cell,CHL)的培養(yǎng)36
• 3.1.2.7 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染36-37
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-40
• 3.2.1 七鰓鰻phb2基因擴(kuò)增37
• 3.2.2 七鰓鰻phb2真核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建37-39
• 3.2.3 重組質(zhì)粒rpEGFP-N1-Lm-phb2的真核轉(zhuǎn)染驗(yàn)證39-40
• 3.3 討論40-41
• 3.4 小結(jié)41-42
• 第4章 Lm-PHB2增強(qiáng)CHL和L132細(xì)胞的氧化應(yīng)激耐受性42-51
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法42-44
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與設(shè)備42
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)方法42-44
• 4.1.2.1 rLm-PHB2的誘導(dǎo)表達(dá)42-43
• 4.1.2.2 rLm-PHB2的純化與定量43
• 4.1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)43-44
• 4.1.2.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)44
• 4.1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染44
• 4.1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)44
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-49
• 4.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化44-45
• 4.2.2 重組蛋白rLm-PHB2增強(qiáng)CHL和L132細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受性45-48
• 4.2.3 真核表達(dá)Lm-PHB2增強(qiáng)CHL細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受性48-49
• 4.3 討論49-50
• 4.4 小結(jié)50-51
• 第5章 七鰓鰻PHB2增強(qiáng)細(xì)胞氧化應(yīng)激耐受作用的機(jī)制初探51-59
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料與方法51-53
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑與設(shè)備51
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-53
• 5.1.2.1 真核表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染51
• 5.1.2.2 激光共聚焦顯微鏡熒光檢測(cè)51-52
• 5.1.2.3 QPCR檢測(cè)phb2、tp53、vdac3在七鰓鰻各組織中的表達(dá)52-53
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-57
• 5.2.1 RNA提取結(jié)果53
• 5.2.2 氧化應(yīng)激狀態(tài)下Lm-PHB2蛋白的定位及遷移53-54
• 5.2.3 phb2、tp53、vdac3在免疫后七鰓鰻各組織的分布變化54-57
• 5.3 討論57-58
• 5.4 小結(jié)58-59
• 結(jié)論59-60
• 本文創(chuàng)新點(diǎn)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 附錄65-67
• 附錄1 pEGFP-N1質(zhì)粒圖譜65
• 附錄2 阿霉素誘導(dǎo)七鰓鰻氧化應(yīng)激后提取心臟、肝臟、腎臟、腸、肌肉共計(jì)30個(gè)組織樣品反轉(zhuǎn)得到的cDNA濃度65-66
• 附錄3 大腸桿菌免疫七鰓鰻后提取心臟、肝臟、腎臟共計(jì)18個(gè)組織樣品反轉(zhuǎn)得到的cDNA濃度66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況67-68
• 致謝68

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本文編號(hào)：783594