發(fā)布時(shí)間：2017-08-25 11:21

  本文關(guān)鍵詞：致病性壞死梭桿菌120ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的克隆及其特性分析

  更多相關(guān)文章： 壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白 染色體步移 免疫原性分析

【摘要】：壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性桿菌,具有多形性,常引起人的急性咽炎綜合征(Lemierre's Syndrome)和牛、羊、鹿等動(dòng)物的腐蹄病、肝膿腫、壞死性皮炎、犢牛白喉。目前還沒有商品化的壞死梭桿菌疫苗,國(guó)內(nèi)外主要使用抗生素來(lái)治療該病,但是抗生素帶來(lái)的負(fù)面影響越來(lái)越受到人們重視,為了研究120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的生物學(xué)特性,并揭示其作為基因工程亞單位疫苗預(yù)防壞死桿菌病的可行性,本研究根據(jù)已報(bào)道的F.necrophorum 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷酸序列,克隆出該基因完整的核苷酸序列,生物信息學(xué)分析了該蛋白的分子特征,參考抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果,將F.necrophorum 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的開放閱讀框(Open reading frame)分為3個(gè)彼此重疊的基因片段p1、p2、p3,進(jìn)行原核表達(dá),純化的重組蛋白P1、P2、P3分別免疫實(shí)驗(yàn)兔,檢測(cè)兔血清中特異性抗體水平,主要研究?jī)?nèi)容如下:1.根據(jù)已報(bào)道的F.necrophorum 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因部分核苷酸序列(登錄號(hào):AF529887.1),采用染色體步移技術(shù),克隆出該基因完整的核苷酸序列并用高保真酶進(jìn)行驗(yàn)證,全長(zhǎng)4 247 bp,含有一個(gè)3 372 bp的ORF,編碼1 123個(gè)氨基酸,蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為120 ku。生物信息學(xué)分析表明,該蛋白可能是具有血凝活性的外膜自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員,并具有較強(qiáng)的抗原性。2.F.necrophorum 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的原核表達(dá)及純化。參考抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果,將F.necrophorum 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的ORF分為3個(gè)彼此重疊60 bp左右的基因片段p1、p2、p3,構(gòu)建重組表達(dá)載體p ET-28a-p1、p ET-32a-p2、p ET-32a-p3,在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用AKTA purifier蛋白純化系統(tǒng)獲得48 ku、59 ku、62 ku的重組蛋白P1、P2、P3,Western blot分析顯示,純化后的重組蛋白P1、P2、P3具有良好的反應(yīng)原性。3.將純化的重組蛋白P1、P2、P3分別免疫實(shí)驗(yàn)兔,檢測(cè)兔血清中的特異性抗體,結(jié)果顯示,兔血清中的抗體效價(jià)分別為1:32、1:16、1:16,表明重組蛋白均可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)兔產(chǎn)生特異性抗體,具有良好的免疫原性。綜上所述,F.necrophorum 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的克隆及其免疫原性的初步分析,為進(jìn)一步了解120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ),并為基因工程亞單位疫苗和診斷制劑的研制提供了物質(zhì)材料。
【關(guān)鍵詞】：壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白 染色體步移 免疫原性分析
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-14
• 英文縮略表14-15
• 第一章 引言15-21
• 1.1 壞死梭桿菌概述15-18
• 1.1.1 壞死梭桿菌病原特征15-16
• 1.1.2 壞死梭桿菌的致病機(jī)理16
• 1.1.3 壞死梭桿菌的檢測(cè)16-18
• 1.2 未知基因的克隆18-20
• 1.2.1 探針法18
• 1.2.2 接頭法18
• 1.2.3 差減雜交18
• 1.2.4 圖位克隆18-19
• 1.2.5 同源克隆19
• 1.2.6 反向PCR19-20
• 1.2.7 cDNA末端快速擴(kuò)增20
• 1.3 本研究的目的及意義20-21
• 第二章 致病性壞死梭桿菌血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的克隆與生物信息學(xué)分析21-33
• 2.1 材料與方法21-25
• 2.1.1 菌種、載體和試劑21
• 2.1.2 主要儀器21-22
• 2.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成22
• 2.1.4 FN(AB)基因組DNA的提取22
• 2.1.5 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 5’端旁側(cè)序列的克隆與測(cè)序22-24
• 2.1.6 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 3’端旁側(cè)序列的克隆與測(cè)序24
• 2.1.7 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 5’端旁側(cè)序列的驗(yàn)證24
• 2.1.8 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 3’端旁側(cè)序列的驗(yàn)證24
• 2.1.9 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的序列分析24
• 2.1.10 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的生物信息學(xué)分析24-25
• 2.2 結(jié)果與分析25-31
• 2.2.1 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 5’端旁側(cè)序列的克隆與測(cè)序25-26
• 2.2.2 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 3’端旁側(cè)序列的克隆與測(cè)序26
• 2.2.3 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 5’端旁側(cè)序列的驗(yàn)證26-27
• 2.2.4 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因 3’端旁側(cè)序列的驗(yàn)證27
• 2.2.5 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的序列分析27-28
• 2.2.6 FN(AB)120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的生物信息學(xué)分析28-31
• 2.3 討論31-33
• 第三章 致病性壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白基因的分段克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建33-43
• 3.1 材料與方法33-37
• 3.1.1 菌種與載體33
• 3.1.2 主要試劑33
• 3.1.3 主要儀器33-34
• 3.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成34
• 3.1.5 基因片段p1、p2、p3的PCR擴(kuò)增34-35
• 3.1.6 基因片段p1、p2、p3 PCR產(chǎn)物的回收35
• 3.1.7 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建35
• 3.1.8 重組克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Trans T135
• 3.1.9 重組克隆質(zhì)粒的提取35
• 3.1.10重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定35
• 3.1.11重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定35-36
• 3.1.12重組克隆質(zhì)粒的測(cè)序鑒定36
• 3.1.13重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建36
• 3.1.14重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Trans T136
• 3.1.15重組表達(dá)質(zhì)粒的提取36-37
• 3.1.16重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定37
• 3.1.17重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定37
• 3.1.18重組表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序鑒定37
• 3.1.19重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）plysS37
• 3.1.20重組表達(dá)質(zhì)粒的提取與鑒定37
• 3.2 結(jié)果與分析37-41
• 3.2.1 基因片段p1、p2、p3的擴(kuò)增37-38
• 3.2.2 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定38-39
• 3.2.3 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定39
• 3.2.4 重組克隆質(zhì)粒的測(cè)序鑒定39-40
• 3.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定40
• 3.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定40-41
• 3.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序鑒定41
• 3.3 討論41-43
• 第四章 致病性壞死梭桿菌 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的原核表達(dá)及純化43-54
• 4.1 材料與方法43-45
• 4.1.1 主要試劑43
• 4.1.2 主要儀器43
• 4.1.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中最適表達(dá)條件的篩選43
• 4.1.4 SDS-PAGE分析43-44
• 4.1.5 P1、P2、P3的大量表達(dá)44
• 4.1.6 P1、P2、P3的分離純化44-45
• 4.1.7 Western blot分析45
• 4.2 結(jié)果與分析45-52
• 4.2.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中最適表達(dá)條件的摸索45-51
• 4.2.2 純化產(chǎn)物P1、P2、P3的SDS-PAGE分析51-52
• 4.2.3 Western blot分析52
• 4.3 討論52-54
• 第五章 致病性壞死梭桿菌重組 120 ku血凝素相關(guān)外膜蛋白的兔體免疫試驗(yàn)54-56
• 5.1 材料與方法54-55
• 5.1.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物54
• 5.1.2 主要儀器54
• 5.1.3 抗原的制備54
• 5.1.4 動(dòng)物分組及免疫程序54
• 5.1.5 兔血清的抗體檢測(cè)54-55
• 5.2 結(jié)果與分析55
• 5.2.1 兔血清的抗體檢測(cè)55
• 5.3 討論55-56
• 第六章 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-63
• 致謝63-64
• 附錄64-77
• 作者簡(jiǎn)歷77

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王宏俊;張培君;龔玉梅;楊漢春;;B型副雞嗜血桿菌血凝素基因的克隆表達(dá)及生物活性鑒定[J];畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào);2007年01期

2 ;科技動(dòng)態(tài)[J];中國(guó)家禽;2006年24期

3 章銀梅,楊月琴,朱小榮,湯懋z，

本文編號(hào)：736637