本文關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏菌GroEL和GroES蛋白生物活性及不同應(yīng)激條件對其表達(dá)量的影響

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【摘要】：熱休克蛋白GroEL蛋白和其輔助伴侶蛋白GroES蛋白作為熱休克蛋白家族中的重要成員,在細(xì)菌抵抗外界不良環(huán)境時發(fā)揮著重要作用。本文對鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)的GroEL蛋白和其輔助因子GroES蛋白基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)和純化,檢測了GroEL和GroES蛋白的生物活性以及不同應(yīng)激條件對其表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果如下：1. GroEL和GroES基因的原核表達(dá)及GroEL-GroES融合表達(dá)以RA CH-1株基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增出GroEL和GroES基因片段,并克隆到pMD19-T載體上。利用原核表達(dá)系統(tǒng)pET-28a(+)表達(dá)重組蛋白GroEL和GroES,采用親和層析法純化得到GroEL和GroES重組蛋白。經(jīng)過SDS-PAGE分析兩種蛋白的分子量約為65 kDa和15 kDa。通過分別擴(kuò)增RA GroEL和GroES基因,然后運(yùn)用重疊PCR將GroEL和GroES基因通過Linker連接構(gòu)建得到融合基因GroEL-GroES,將其定向克隆到pMD19-T載體上。再將GroEL-GroES目的基因定向插入pET-28a(+)原核表達(dá)系統(tǒng),通過SDS-PAGE分析,融合表達(dá)的GroEL-GroES蛋白分子量約為70kD。2. GroEL和GroES蛋白同源模建與分析及活性研究基于同源模建軟件Modeller預(yù)測了GroEL和GroES蛋白的三維結(jié)構(gòu),所預(yù)測的蛋白結(jié)構(gòu)合理性采用Procheck軟件進(jìn)行評估。結(jié)果顯示GroEL和GroES蛋白模建后的結(jié)構(gòu)均能與模板能很好的疊合。用Autodock4.0軟件將GroEL結(jié)構(gòu)模型與ATP進(jìn)行自動對接,分析二者之間的相互作用,發(fā)現(xiàn)ATP的嘌呤環(huán)能夠伸入GroEL蛋白由氨基酸殘基ALA-2, LEU-524和PRO-525所組成的疏水性腔袋,同時ATP三磷酸基團(tuán)分別與氨基酸殘基ASP-4和ILE-5形成氫鍵,GroEL可與ATP形成穩(wěn)定的復(fù)合物。本試驗分別測定了GroEL和GroEL-GroES蛋白在15-70℃的ATP酶活性,發(fā)現(xiàn)GroEL和GroEL-GroES蛋白在55℃左右時酶活性最高,且活性隨溫度變化而變化,但GroEL和GroEL-GroES蛋白的酶活性無顯著性差異。GroES在30-55℃時能夠提高GroEL的ATP酶活性,但在55℃后對GroEL的ATP酶活性無明顯影響。3.不同應(yīng)激條件對GroEL和GroES基因表達(dá)量的影響通過RT-qPCR技術(shù),對不同應(yīng)激環(huán)境條件下RA CH-1株GroEL和GroES基因表達(dá)量變化進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,在不同熱激溫度下,GroEL和GroES基因表達(dá)量隨熱激溫度的升高而升高。在55℃熱激時,GroEL和GroES基因的表達(dá)量達(dá)到最高,GroEL和GroES基因分別上調(diào)了3.59倍和3.62倍,差異顯著(P0.05)。在低濃度H202濃度(1.25%和2.5%)條件下,GroEL基因表達(dá)量明顯上調(diào),其表達(dá)量分別為對照組的2.45倍和2.22倍(P0.05)。GroES基因僅在1.25%濃度條件下,相對表達(dá)量明顯升高,其表達(dá)量為對照組的2.62倍(P0.05),但在2.5%濃度條件下,表達(dá)量下調(diào),差異不顯著(P0.05)。在高濃度H2O2(5%)作用下,GroEL和GroES基因表達(dá)量均受到抑制(P0.05)。不同pH對RA作用10min后均引起GroEL和GroES基因mRNA的表達(dá)水平的變化。在酸性條件(pH=3)下,GroEL和GroES基因mRNA的表達(dá)量,分別為對照組(pH=7)的2.105倍和4.683倍(P0.05)。在堿性條件(pH=10), GroEL和GroES基因mRNA的表達(dá)量分別上調(diào)了4.8%和51.3%,但與對照組相比,差異不顯著(P0.05)。結(jié)果表明,酸性環(huán)境顯著影響GroEL和GroES基因的表達(dá)量,而堿性環(huán)境對GroEL和GroES基因的表達(dá)量無明顯影響。在低鹽濃度(3%)條件下,與普通TSB培養(yǎng)基比較,GroEL和GroES基因在含有3%NaCl TSB培養(yǎng)基中受到誘導(dǎo),表達(dá)上調(diào),表達(dá)差異顯著(P0.05); GroEL和GroES基因在含有6%NaCl TSB培養(yǎng)基中表達(dá)量下降,且GroES基因下降明顯(P0.05)。
【關(guān)鍵詞】：鴨疫里默氏菌 GroEL GroES ATPase酶活性 應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 英文縮寫詞匯7-10
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述10-16
• 1 鴨疫里默氏菌的概述10-11
• 2 GroEL和GroES研究進(jìn)展11-15
• 2.1 熱休克蛋白概述11-12
• 2.2 GroEL和GroES的基本結(jié)構(gòu)12-13
• 2.3 GroEL和GroES的生物學(xué)功能13-15
• 3 本研究的目的意義15-16
• 第二部分 試驗研究16-54
• 1 試驗材料16-19
• 1.1 菌株及載體16
• 1.2 主要試劑16
• 1.3 主要試劑的配制16-18
• 1.4 儀器與器材18-19
• 2 試驗方法19-31
• 2.1 鴨疫里默氏菌GroEL和GroES基因克隆及生物信息學(xué)分析19-21
• 2.2 鴨疫里默氏菌GroEL-GroES融合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建21-23
• 2.3 GroEL、GroES和GroEL-GroES蛋白的表達(dá)及純化23-25
• 2.4 GroEL和GroES重組蛋白生物活性的研究25-28
• 2.5 不同應(yīng)激條件對RA GroEL和GroES基因表達(dá)量的影響28-31
• 3 結(jié)果31-50
• 3.1 GroEL和GroES基因克隆、原核表達(dá)及純化31-36
• 3.2 GroEL-GroES串聯(lián)基因的克隆、原核表達(dá)及純化36-38
• 3.3 GroEL和GroES蛋白生物活性檢測38-44
• 3.4 不同應(yīng)激條件對RA GroEL和GroES基因表達(dá)量的影響44-50
• 4 討論50-53
• 5 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 致謝60-61
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61

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本文編號：570255