本文關(guān)鍵詞：水稻OGG1基因的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：OGG1 (8-oxoguanine DNA glycosylase)為8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶,主要修復DNA氧化損傷,維護DNA及基因組穩(wěn)定,人OGG1 (hOGG1)突變易誘發(fā)多種腫瘤。已有研究表明擬南芥OGG1 (AtOGG1)與種子成熟和萌發(fā)有關(guān),影響種子壽命,但尚不清楚水稻OGG1 (OsOGG1)在DNA氧化損傷修復、逆境脅迫及種子壽命調(diào)控的作用模式。為剖析OsOGG1功能,我們構(gòu)建了OsOGG1超表達、RNAi、亞細胞定位、原核細胞表達及啟動子持久表達載體,獲得了相應的轉(zhuǎn)基因株系。隨后,我們對轉(zhuǎn)基因株系及有關(guān)材料進行分子驗證與功能分析,包括啟動子活性檢測,煙草細胞瞬時表達,脅迫處理與基因表達及從大腸桿菌純化GST-OsOGG1蛋白等。結(jié)果如下：(1)GUS染色分析表明,OsOGG1起始密碼子前1331 bp片斷能啟動GUS基因表達,具有啟動子活性。(2)煙草細胞共聚焦熒光觀察顯示OsOGG1定位于細胞核。(3)農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻日本晴,獲得了超表達和RNAi沉默轉(zhuǎn)基因T1代植株分別為38株和54株,通過對轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定,已篩選獲得6個超表達和9個RNAi沉默轉(zhuǎn)基因陽性株系的T2代種子,我們將鑒定獲得單拷貝的超表達和RNAi沉默轉(zhuǎn)基因T2代純系,用于后續(xù)試驗分析。(4)水稻幼苗非生物脅迫(二甲基紫精30 μM Dimethyl amethyst、高溫38℃、低溫4℃、高鹽250 mM NaCl和高滲20% PEG 6000)實驗表明,二甲基紫精誘導的OsOGG1表達與超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)活性變化趨勢一致,高鹽、高溫及低溫處理均在3h處抑制OsOGG1表達,高滲透壓處理誘導OsOGG1表達,表明OsOGG1與非生物脅迫有一定關(guān)聯(lián),其作用機理有待進一步研究。(5)水稻種子萌發(fā)試驗顯示在種子吸漲24 h時,日本晴、超表達和RNAi沉默株系的OsOGG1表達量最高,表明OsOGG1可能與水稻種子萌發(fā)有關(guān)。(6)原核表達OsOGG1蛋白及純化了OsOGG1,并獲得了OsOGG1多克隆抗體,為OsOGG1介導的DNA氧化損傷修復功能鑒定提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：水稻 OsOGG1 啟動子 亞細胞定位 轉(zhuǎn)基因株系 非生物脅迫 原核表達
【學位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S511
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 前言9-15
• 1.1 植物抗逆機制研究9-10
• 1.2 非生物脅迫影響水稻生產(chǎn)10
• 1.3 逆境脅迫誘導ROS積累與DNA損傷10-11
• 1.4 OGG1參與堿基切除修復途徑11-12
• 1.5 OGG1概述及研究現(xiàn)狀12-13
• 1.6 OGG1介導抗逆及相關(guān)應用13-14
• 1.7 研究背景、目的和意義14-15
• 第2章 材料與方法15-32
• 2.1 實驗材料、試劑及實驗儀器15-20
• 2.1.1 實驗材料15
• 2.1.2 試劑和藥品15-16
• 2.1.3 試劑配制16-20
• 2.1.4 儀器及設備20
• 2.2 實驗方法20-32
• 2.2.1 生物信息學分析應用20
• 2.2.2 OsOGG1及其啟動子克隆20-21
• 2.2.3 膠回收方法21-22
• 2.2.4 質(zhì)粒提取方法22
• 2.2.5 水稻DNA及RNA提取方法22-24
• 2.2.6 第一鏈cDNA合成24
• 2.2.7 qRT-PCR引物設計24-25
• 2.2.8 實時定量PCR反應25
• 2.2.9 煙草注射異源表達蛋白25-26
• 2.2.10 融合蛋白誘導表達、提取及純化26-27
• 2.2.11 Western blot檢測方法27-28
• 2.2.12 水稻超表達載體及基因沉默(RNAi)載體構(gòu)建28-31
• 2.2.13 EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化31
• 2.2.14 SOD酶活性測定方法31-32
• 第3章 結(jié)果與分析32-45
• 3.1 OsOGG1基因克隆32
• 3.2 OsOGG1啟動子功能表達分析32-34
• 3.2.1 OsOGG1啟動子克隆及持久表達載體構(gòu)建32-33
• 3.2.2 植物組織GUS染色分析啟動子功能33-34
• 3.3 OsOGG1亞細胞定位分析34-36
• 3.3.1 構(gòu)建OsOGG1亞細胞定位載體34-35
• 3.3.2 融合蛋白OsOGG1-GFP瞬時表達和共聚焦熒光顯微觀察35-36
• 3.4 轉(zhuǎn)基因水稻植株鑒定與篩選36-37
• 3.5 非生物脅迫處理誘導日本晴OsOGG1的表達分析37-39
• 3.6 OsOGG1在水稻干種子及萌發(fā)過程中表達分析39-40
• 3.7 OsOGG1原核蛋白表達、純化及抗體制備40-42
• 3.7.1 OsOGG1原核表達載體構(gòu)建40-41
• 3.7.2 OsOGG1融合蛋白誘導表達分析41
• 3.7.3 OsOGG1融合蛋白純化及Western blot檢測41-42
• 3.8 討論分析42-45
• 第4章 創(chuàng)新性與下一階段工作45-46
• 4.1 創(chuàng)新性45
• 4.2 下一階段工作45-46
• 參考文獻46-53
• 縮略詞53-54
• 致謝54-56
• 作者簡歷56

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 何艷冰;水稻OGG1基因的功能分析[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2015年

2 王勇;OGG1基因在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體中的表達及甲基化研究[D];南通大學;2014年

3 李崢;堿基切除修復基因（APE1、OGG1、XRCC1）多態(tài)性與肺癌遺傳易感性研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

  本文關(guān)鍵詞：水稻OGG1基因的功能分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：471098