本文關鍵詞：仿刺參生長相關基因的克隆與表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：仿刺參(Apostichopus japonicus)俗稱刺參,屬于棘皮動物門(Echinodermata),海參綱(Holothuroidea),循手目(Aspidochirota),刺參科(Stichopodidae),仿刺參屬(Apostichopus)。仿刺參是一種非常重要的海洋經濟棘皮動物,近十幾年仿刺參生長的研究取得較大進展,尤其是水溫、鹽度、光照、附著基、養(yǎng)殖密度和餌料等環(huán)境因素對刺參生長影響的相關研究已經較多和深入,在遺傳和發(fā)育生物學方面的研究也有一定進展。但是,關于生長方面的分子遺傳學研究非常少。細胞周期蛋白B(Cyclin B)、卵泡抑素(Follistatin,Fst)和下效應蛋白(Tensilin)基因是參與生長調控的相關基因,在刺參的生長發(fā)育過程中起著重要作用。Cyclin B主要通過控制細胞分裂G2/M這個轉換點來調控細胞分裂,是真核細胞周期運轉中起關鍵作用的調控因子。卵泡抑素是一種富含半胱氨酸的糖基化單鏈多肽,是轉化生長因子β超家族成員之一,抑制促卵泡素(FSH)的分泌。下效應蛋白是一種膠原纖維結合蛋白,是由仿刺參真皮的內部的一層異變的膠原組織產生。本實驗以仿刺參為原料,利用分子生物學技術,首次克隆了cyclin B、follistatin、tensilin基因,獲得了3個基因cDNA全序列。通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),cyclin B基因包含一個717bp的開放閱讀框,編碼一個由238個氨基酸組成的蛋白,follistatin基因包含一個1254bp的開放閱讀框,編碼一個由417個氨基酸組成的蛋白,tensilin基因包含一個822bp的開放閱讀框,編碼一個由273個氨基酸組成的蛋白。對這三種基因編碼的蛋白質進行預測分析。Cyclin B包括一個CYCLIN功能結構域,無信號肽無跨膜結構域。Follistatin包括6個功能結構域,按順序分別是FOLN、KAZAL、FOLN、KAZAL、FOLN、KAZAL結構域,有信號肽無跨膜結構域。Tensilin包括一個NTR功能結構域,有信號肽無跨膜結構域。用實時定量PCR(Real-Time qPCR)技術,對cyclin B、follistatin、tensilin基因在大小仿刺參不同組織的表達量分別進行研究。發(fā)現(xiàn)cyclin B基因在大個體仿刺參中的相對表達量要略高于小個體的表達量,體液和肌肉中差異極顯著,在呼吸樹中差異顯著。follistatin基因在小個體仿刺參中各組織相對表達量要略高,在腸中表達量差異顯著,其余差異不顯著。小個體仿刺參體壁最高為1.14,呼吸樹為0.047。tensilin基因在呼吸樹的表達量最高為1.14,體液的表達量最低為0.067。利用基因組步移(Genome Walking)方法,對cyclin B基因進行了啟動子的克隆,得到了2564bp的啟動子序列,利用啟動子轉錄結合位點預測程序進行預測,預測結果顯示有7個結合位點,分別為v-Myb、HNF-1、Evi-1、Elk-1、NF-Y、HNF、USF。
【關鍵詞】：仿刺參 細胞周期蛋白B基因 卵泡抑素基因 下效應蛋白基因
【學位授予單位】：遼寧師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 1.前言9-15
• 1.1 仿刺參概述9-12
• 1.1.1 仿刺參的特征簡介9
• 1.1.2 仿刺參的養(yǎng)殖現(xiàn)狀及存在的問題9-10
• 1.1.3 仿刺參生長發(fā)育以及再生相關基因研究進展10-11
• 1.1.4 仿刺參生長相關問題的解決辦法和展望11
• 1.1.5 仿刺參生長相關問題的研究意義11-12
• 1.2 生長相關基因cyclin B、follistatin、tensilin介紹12-15
• 1.2.1 Cyclin B的作用機制12-13
• 1.2.2 Follistatin作用機制及研究情況13-14
• 1.2.3 Tensilinz功能與研究情況簡介14-15
• 2.材料及方法15-27
• 2.1 材料15-16
• 2.1.1 仿刺參的取樣15
• 2.1.2 主要儀器與設備15-16
• 2.1.3 主要試劑16
• 2.2 方法16-27
• 2.2.1 仿刺參不同組織總RNA和DNA的提取16-19
• 2.2.2 3′ RACE擴增19-20
• 2.2.3 5′ RACE擴增20-22
• 2.2.4 內含子的擴增22-23
• 2.2.5 啟動子的擴增23-25
• 2.2.6 實時定量PCR25-27
• 3.結果27-43
• 3.1 PCR擴增結果及序列分析27-32
• 3.2 cDNA序列信息學分析32-40
• 3.2.1 氨基酸序列32-35
• 3.2.2 編碼蛋白的信號肽預測35-37
• 3.2.3 跨膜結構域預測37-39
• 3.2.4 功能結構域預測39-40
• 3.3 cyclin B基因啟動子序列轉錄結合位點分析預測40-41
• 3.4 實時定量PCR41-43
• 4.討論43-46
• 結論46-47
• 參考文獻47-51
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表學術論文情況51-52
• 致謝52

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本文編號：435178