本文關(guān)鍵詞：表達雞傳染性喉氣管炎病毒gI和gB基因的重組新城疫病毒的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：雞傳染性喉氣管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病,是影響世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。目前主要使用修飾過的ILTV活病毒疫苗、以火雞皰疹病毒(Turkey herpesvirus,HVT)和以痘病毒(Fowlpox virus,FPV)為載體的載體疫苗來預防ILT。然而,ILTV活病毒疫苗在機體傳代的過程中可能發(fā)生毒力返強,并且導致潛伏感染,而HVT和FPV的活載體疫苗免疫保護效果不如弱毒疫苗有效,因此有必要研發(fā)更加有效的疫苗來預防ILT。ILTV基因組為線性雙鏈DNA,大小在150 kb左右,含有76個開放閱讀框(Open reading frame,ORF),編碼至少11種囊膜糖蛋白,UL27和US7分別編碼病毒的糖蛋白gB和gI。gI和gE形成異源二聚體,促進病毒在細胞間的擴散。gB是病毒感染所必須的,參與膜融合、病毒入侵過程。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的危害養(yǎng)禽業(yè)的重大烈性傳染病。NDV基因組是不分節(jié)段、單股、負鏈RNA,編碼8種蛋白。根據(jù)其致病性將NDV分為弱毒株、中等毒力毒株和強毒株。目前,新城疫弱毒株,如La Sota毒株,被廣泛用作疫苗來預防NDV,而且弱毒株作為活病毒載體,通過反向遺傳操作系統(tǒng),常用于表達人類和動物其他病毒的外源基因,研制重組病毒作為疫苗或其他生物制品。ILTV LJS09株是從中國江蘇省某養(yǎng)殖場分離到的一株強毒株,其全基因組已經(jīng)被測序。本研究根據(jù)GenBank上登錄的ILTV LJS09株全基因組(登錄號:JX458822)序列,將gB基因分為前后部分重疊的2段,分別設(shè)計擴增引物,同時設(shè)計擴增gI全長的引物,通過基因克隆技術(shù),將3個基因片段克隆于表達載體PCAGGS中,首先通過酶切分析及序列測定,驗證其編碼框是否正確,然后將該重組載體進一步用于感染性克隆載體的構(gòu)建及重組病毒的拯救。本研究用的NDV基因組全長cDNA克隆以pBR322為骨架載體,通過克隆La Sota毒株基因組構(gòu)建,在NDV cDNA的P和M之間,即基因組的3 165 bp位置有引入Pme I酶切位點,外源基因克隆到此位置。本研究拯救了表達ILTV LJS09株的gI、兩個gB基因片段的重組新城疫病毒,分別命名為r La-gI,r La-gBN,r La-gBC。對三個重組病毒救獲后進行RT-PCR、間接免疫熒光(IFA)、蛋白免疫印跡(Western Blot),評價重組病毒的遺傳穩(wěn)定性、外源蛋白表達穩(wěn)定性,結(jié)果表明三個外源蛋白基因可穩(wěn)定存在至少二十代,而且都在重組病毒感染的細胞中得到有效表達。通過測定和比較重組病毒與野毒株La Sota的HA、EID50、MDT,表明重組病毒保持了La Sota疫苗株高滴度的雞胚生長特及病毒的低致病性。此外,重組病毒的生長動力學曲線與疫苗株相似,在感染后72 h時病毒滴度達到最大。動物免疫攻毒實驗表明,三個重組病毒免疫機體后,均可誘導機體產(chǎn)生針對NDV的高水平的抗體,但用ELISA檢測不到針對ILTV的抗體;NDV強毒株F48E9攻毒后,免疫組可被完全保護,對照組全部死亡,排毒率明顯低于對照組,表明重組病毒的免疫對新城疫強毒的攻擊具有良好的保護作用;ILTV強毒株WG攻毒后,三個重組病毒免疫組在發(fā)病率、死亡率以及排毒率方面與對照組均沒有明顯的差異。重組病毒rLa-gBN,r La-gBC不能提供保護效果,推測可能是由于外源蛋白表達太少且外源蛋白沒有組裝進病毒粒子等原因引起,具體的機制有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：新城疫病毒 反向遺傳操作 雞傳染性喉氣管炎病毒 gI gB
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 英文縮略表11-12
• 1 引言12-18
• 1.1 傳染性喉氣管炎病毒分子生物學及其疫苗研究進展12-15
• 1.1.1 ILTV基因組結(jié)構(gòu)及特性12-13
• 1.1.2 ILTV結(jié)構(gòu)蛋白與生物學功能13-14
• 1.1.3 ILTV疫苗研究進展14-15
• 1.2 新城疫病毒及作為病毒載體的應用15-17
• 1.2.1 新城疫病毒分子生物學特性15-16
• 1.2.2 新城疫病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的應用16-17
• 1.3 研究的目的和意義17-18
• 2 材料和方法18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 細胞、病毒株、質(zhì)粒、SPF雞胚及SPF雞18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要儀器18
• 2.1.4 主要試劑配置18-19
• 2.1.5 引物設(shè)計19-20
• 2.2 方法20-30
• 2.2.1 真核表達載體的構(gòu)建及鑒定20-22
• 2.2.2 間接免疫熒光鑒定目的基因在真核表達載體中表達22-23
• 2.2.3 重組病毒基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建及鑒定23-25
• 2.2.4 病毒拯救25-26
• 2.2.5 間接免疫熒光26
• 2.2.6 Western Blot26-27
• 2.2.7 重組病毒的致病性27
• 2.2.8 重組病毒的穩(wěn)定性27
• 2.2.9 重組病毒的雞胚生長特性27-28
• 2.2.10 重組病毒的免疫保護試驗28-30
• 3 結(jié)果30-44
• 3.1 重組病毒的拯救30-38
• 3.1.1 gI、gBN、gBC基因的擴增及鑒定30-32
• 3.1.2 真核表達質(zhì)粒與重組病毒cDNA克隆的構(gòu)建及鑒定32-38
• 3.2 重組病毒的體外生物學特性38-42
• 3.2.1 重組病毒的雞胚內(nèi)生長特性38-40
• 3.2.2 重組病毒的穩(wěn)定性40-42
• 3.2.3 重組病毒的致病性42
• 3.3 重組病毒免疫效果評價42-44
• 3.3.1 重組病毒免疫后機體內(nèi)抗體效價變化42-43
• 3.3.2 攻毒后發(fā)病率、死亡率及排毒情況43-44
• 4 討論44-47
• 5 全文結(jié)論47-48
• 參考文獻48-53
• 致謝53-54
• 作者簡歷54

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 葛金英;溫志遠;王永;鮑恩東;步志高;;表達綠色熒光蛋白重組新城疫病毒LaSota疫苗株的構(gòu)建[J];微生物學報;2006年04期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃海瓊;表達雞傳染性喉氣管炎病毒gB基因的重組馬立克病毒疫苗株的構(gòu)建[D];揚州大學;2013年

  本文關(guān)鍵詞：表達雞傳染性喉氣管炎病毒gI和gB基因的重組新城疫病毒的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：418331