本文關(guān)鍵詞：基于龍眼轉(zhuǎn)錄組的SSR引物開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：以‘紅核子’龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行EST-SSR分子標(biāo)記研究,共計(jì)開(kāi)發(fā)多態(tài)性引物11對(duì),完成EST-SSR-PCR試驗(yàn)體系的優(yōu)化,將所優(yōu)化的EST-SSR標(biāo)記應(yīng)用于龍眼的親緣關(guān)系分析,并與ISSR分子標(biāo)記進(jìn)行比較分析。具體研究結(jié)果如下：1龍眼EST-SSR位點(diǎn)特征分析以本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料,經(jīng)MISA軟件的SSR位點(diǎn)檢索與分析,共檢索出5710個(gè)EST-SSR位點(diǎn),且EST-SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為8.28%,位點(diǎn)間平均距離為5.41 kb,包含796種基元。從數(shù)量上分析,二核苷基元和三核苷基元所占比例最大,分別為43.35%和32.73%,二者共占總EST-SSR位點(diǎn)的76.08%,為優(yōu)勢(shì)核苷基元。從EST-SSR位點(diǎn)的基元種類來(lái)看,六核苷基元與五核苷基元的種類最多,分別為389種和244種,所占比例分別為48.87%和30.65%,二者占全部EST-SSR基元種類的79.52%。EST-SSR位點(diǎn)的檢索結(jié)果還表明,二核苷酸基元中,(AG)n=(TC)n和(CT)n=(GA)n所占比例分別為17.55%和15.17%,是優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型；而(CG)n=(GC)n重復(fù)類型出現(xiàn)頻率最低,僅為0.00725%,表現(xiàn)出明顯的GC偏倚性；在三核苷基元中,(AGA)n=(TCT)n是最優(yōu)重復(fù)類型,占總EST-SSRs的比例為2.92%,其次為(CTT)n=(GAA)n、 (AAG)n=(TTC)n,所占比例分別為2.71%、2.59%。綜上,紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組序列中EST-SSR位點(diǎn)含量豐富。2龍眼EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化通過(guò)L16(44)正交試驗(yàn),得到龍眼EST-SSR-PCR的最優(yōu)應(yīng)體系為：DNA模板80 ng,0.15 mmol/L dNTPs 2μL,0.1 μmol/L上下游引物各1 μL, Tap酶1.5 U；非優(yōu)化試驗(yàn)因素10×PCR Buffer (1.5mM Mg2+) 2.5 μL, ddH2O補(bǔ)足至25μL。分別隨機(jī)選取3對(duì)引物和8份龍眼種質(zhì)樣本的DNA作為模板對(duì)該優(yōu)化體系進(jìn)行驗(yàn)證,電泳結(jié)果顯示：擴(kuò)增條帶清晰平整、無(wú)引物二聚體、無(wú)非特異擴(kuò)增、背景干擾小,說(shuō)明得到的優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠。3龍眼EST-SSR多態(tài)性分析依據(jù)所分析的龍眼EST-SSR位點(diǎn)序列特征,使用Primer Premier 5軟件共設(shè)計(jì)50對(duì)長(zhǎng)度在18-24 bp的引物,引物對(duì)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100-300 bp。再以‘立冬本’的DNA為模板,對(duì)所設(shè)計(jì)引物的可用性進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示50對(duì)引物中共有19對(duì)的擴(kuò)增片段符合預(yù)期大小。進(jìn)一步以95份供試龍眼種質(zhì)的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示,其中有11對(duì)引物擴(kuò)增的多態(tài)性良好,主帶明亮清晰,無(wú)拖尾、無(wú)彌散、背景干擾小,多態(tài)性引物開(kāi)發(fā)得率達(dá)22%。這11對(duì)引物在95份龍眼種質(zhì)中的擴(kuò)增多態(tài)性表現(xiàn)為：共獲得114條譜帶,多態(tài)性位點(diǎn)比例達(dá)100%；多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)量分布范圍在5-25個(gè),其中LY-43引物對(duì)所擴(kuò)增的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)最多(共25個(gè)),LY-9引物對(duì)的多態(tài)性位點(diǎn)最少(僅5個(gè))；平均每個(gè)龍眼EST-SSR標(biāo)記能夠擴(kuò)增10.36條多態(tài)性譜帶,說(shuō)明基于紅核子龍眼EC轉(zhuǎn)錄組開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記具有豐富多態(tài)性。4龍眼EST-SSR與ISSR的比較分析本試驗(yàn)分別運(yùn)用EST-SSR與ISSR對(duì)95份供試龍眼種質(zhì)進(jìn)行了親緣關(guān)系研究。EST-SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)的11對(duì)引物對(duì)供試龍眼材料擴(kuò)增譜帶的分布范圍為5-25條,分布范圍較廣,每對(duì)引物的平均多態(tài)位點(diǎn)為10.36個(gè)；ISSR分子標(biāo)記所使用的10對(duì)UBC引物對(duì)供試龍眼材料擴(kuò)增譜帶分布范圍8-12條,分布范圍較窄,每對(duì)引物的平均多態(tài)位點(diǎn)為9.50個(gè)；EST-SSR擴(kuò)增的平均多態(tài)性位點(diǎn)比ISSR多。此外,電泳結(jié)果表明EST-SSR標(biāo)記所開(kāi)發(fā)的特異引物比ISSR分子標(biāo)記通用UBC引物更能高效結(jié)合到樣本DNA；從開(kāi)發(fā)所得的11對(duì)EST-SSR引物中獲得5對(duì)特異標(biāo)記：LY-5、LY-38、LY-43、LY-45、LY-48,若加大龍眼EST-SSR特異標(biāo)記引物的開(kāi)發(fā)力度,將有利于龍眼種質(zhì)資源的鑒別�；贓ST-SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果顯示95份供試龍眼種質(zhì)能被有效區(qū)分,聚類結(jié)果為2大組、8類群。其中,‘荔枝龍眼’單獨(dú)聚為一組,表明其遺傳背景獨(dú)特,有別于其他龍眼種質(zhì)；‘荔枝龍眼’和‘荔龍’不是同一品種。一些地方品種如‘南安1號(hào)’和‘農(nóng)科所3號(hào)’被聚類在一起,表明其遺傳背景相似；供試的東壁龍眼種質(zhì)被聚類為不同的類群,說(shuō)明不同東壁品種龍眼之間仍存在遺傳多態(tài)性；此外也揭示出個(gè)別品種如‘碼頭1號(hào)’與‘碼頭2號(hào)’存在遺傳差異。以上結(jié)論與ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果契合,表明兩種分子標(biāo)記能揭示出龍眼聚類的共性與差異性。綜合分析擴(kuò)增效果及聚類結(jié)果,認(rèn)為龍眼EST-SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)有效,能將其運(yùn)用到龍眼親緣關(guān)系分析中。
【關(guān)鍵詞】：龍眼 轉(zhuǎn)錄組 SSR 引物開(kāi)發(fā) 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S667.2
【目錄】：

• 縮寫詞9-11
• 摘要11-13
• Abstract13-17
• 第一章 引言17-25
• 1 龍眼種質(zhì)資源概述17-18
• 2 分子標(biāo)記在龍眼上的應(yīng)用18-20
• 3 SSR分子標(biāo)記技術(shù)20-22
• 3.1 SSR的定義及原理20
• 3.2 SSR分子標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)20-21
• 3.3 SSR分子標(biāo)記的分類21
• 3.4 SSR標(biāo)記在植物上的應(yīng)用21-22
• 3.4.1 構(gòu)建植物遺傳連鎖圖譜21
• 3.4.2 植物親緣關(guān)系及遺傳多樣性研究21-22
• 3.4.3 植物種質(zhì)資源的鑒定分析22
• 3.4.4 開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記的途徑22
• 4 本研究的目的意義及主要內(nèi)容22-25
• 4.1 本研究的目的意義22-23
• 4.2 本研究的主要內(nèi)容23-25
• 第二章 龍眼EST-SSR位點(diǎn)分析25-32
• 1 材料與方法25-26
• 1.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及分析軟件25
• 1.2 方法25-26
• 1.2.1 龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特征25
• 1.2.2 龍眼EST-SSR位點(diǎn)信息檢索25-26
• 2 結(jié)果與分析26-29
• 2.1 龍眼EST-SSR位點(diǎn)信息出現(xiàn)頻率及總體特征26
• 2.2 龍眼EST-SSR位點(diǎn)出現(xiàn)比例及長(zhǎng)度特征26-27
• 2.3 龍眼EST-SSR位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基元出現(xiàn)頻率及比例27-29
• 3 討論29-32
• 3.1 龍眼EST-SSR位點(diǎn)含量豐富29-30
• 3.2 龍眼EST-SSR基元數(shù)量與種類豐富30-32
• 第三章 EST-SSR引物初篩與體系優(yōu)化32-41
• 1 材料與方法32-35
• 1.1 材料32
• 1.1.1 植物材料與分析軟件32
• 1.1.2 藥品耗材與儀器設(shè)備32
• 1.2 方法32-35
• 1.2.1 龍眼EST-SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)33
• 1.2.2 龍眼總DNA提取及檢測(cè)33-34
• 1.2.3 SSR-PCR反應(yīng)預(yù)擴(kuò)增及龍眼EST-SSR標(biāo)記引物初步篩選34
• 1.2.4 龍眼SSR-PCR體系優(yōu)化34-35
• 1.2.5 SSR-PCR優(yōu)化體系驗(yàn)證35
• 2 結(jié)果與分析35-39
• 2.1 龍眼EST-SSR引物初步篩選35-37
• 2.2 SSR-PCR體系L_(16)(4~4)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析37-38
• 2.3 最優(yōu)SSR-PCR反應(yīng)體系的驗(yàn)證分析38-39
• 3 討論39-41
• 3.1 龍眼SSR-PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定可靠39-40
• 3.2 龍眼EST-SSR標(biāo)記引物多態(tài)性良好40-41
• 第四章 龍眼EST-SSR標(biāo)記在親緣關(guān)系分析上的應(yīng)用及其與ISSR的比較分析41-65
• 第一節(jié) 龍眼EST-SSR在親緣關(guān)系分析上的應(yīng)用41-51
• 1 材料與方法41-44
• 1.1 材料41-42
• 1.1.1 植物材料與分析軟件42
• 1.1.2 藥品耗材與儀器設(shè)備42
• 1.2 方法42-44
• 1.2.1 龍眼總DNA提取及檢測(cè)42
• 1.2.2 多態(tài)性EST-SSR引物開(kāi)發(fā)42
• 1.2.3 SSR-PCR體系與擴(kuò)增程序42
• 1.2.4 SSR-PCR產(chǎn)物檢測(cè)42-43
• 1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析43-44
• 2 結(jié)果與分析44-50
• 2.1 龍眼材料總DNA檢測(cè)44
• 2.2 EST-SSR分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果分析44-47
• 2.3 EST-SSR分子標(biāo)記引物多態(tài)性分析47
• 2.4 基于EST-SSR標(biāo)記的聚類分析47-50
• 3 討論50-51
• 3.1 龍眼EST-SSR擴(kuò)增譜帶多態(tài)性良好50
• 3.2 龍眼EST-SSR聚類能揭示品種差異50-51
• 第二節(jié) ISSR在龍眼親緣關(guān)系研究上的應(yīng)用51-59
• 1 材料與方法52-53
• 1.1 材料52
• 1.1.1 植物材料與分析軟件52
• 1.1.2 藥品耗材與儀器設(shè)備52
• 1.2 方法52-53
• 1.2.1 龍眼總DNA提取及檢測(cè)52
• 1.2.2 ISSR引物選擇52-53
• 1.2.3 ISSR-PCR體系與擴(kuò)增程序53
• 1.2.4 ISSR-PCR產(chǎn)物檢測(cè)53
• 1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析53
• 2 結(jié)果與分析53-59
• 2.1 龍眼材料總DNA檢測(cè)53-54
• 2.2 ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增結(jié)果分析54-56
• 2.3 ISSR分子標(biāo)記引物多態(tài)性分析56
• 2.4 基于ISSR標(biāo)記的聚類分析56-59
• 3 討論59
• 第三節(jié) 龍眼EST-SSR與ISSR的比較分析59-65
• 1 材料與方法60
• 1.1 植物材料與分析軟件60
• 1.2 方法60
• 1.2.1 電泳擴(kuò)增效果比較60
• 1.2.2 聚類結(jié)果比較60
• 2 結(jié)果與分析60-62
• 2.1 EST-SSR與ISSR的擴(kuò)增效果比較分析60-61
• 2.2 EST-SSR與ISSR的聚類結(jié)果比較分析61-62
• 3 討論62-65
• 3.1 龍眼EST-SSR的特異擴(kuò)增效果優(yōu)于ISSR62-63
• 3.2 龍眼EST-SSR可用于龍眼親緣關(guān)系分析63-65
• 第五章 小結(jié)65-68
• 1 龍眼EST-SSR位點(diǎn)含量豐富65
• 2 龍眼EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化65-66
• 3 龍眼EST-SSR標(biāo)記具有豐富多態(tài)性66
• 4 龍眼EST-SSR標(biāo)記與ISSR標(biāo)記的比較分析66-68
• 參考文獻(xiàn)68-74
• 附錄Ⅰ 95份龍眼供試材料74-76
• 附錄Ⅱ 95份龍眼供試材料的DNA檢測(cè)結(jié)果76-77
• 附錄Ⅲ 各EST-SSR標(biāo)記引物對(duì)95份龍眼供試材料的擴(kuò)增結(jié)果77-83
• 附錄Ⅳ 各ISSR標(biāo)記引物對(duì)95份龍眼供試材料的擴(kuò)增結(jié)果83-93
• 致謝93

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 李衛(wèi)華;劉偉;尤明山;許杰;劉春雷;李保云;劉廣田;;利用多種SSR引物構(gòu)建小麥遺傳連鎖圖譜及其多態(tài)性分析[J];麥類作物學(xué)報(bào);2007年01期

2 車永和;李立會(huì);;小麥SSR引物在冰草屬植物分析應(yīng)用中的評(píng)價(jià)[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào);2006年06期

3 王彪,常汝鎮(zhèn),陶莉,關(guān)榮霞,閆麗,張明恢,馮忠孚,邱麗娟;分析中國(guó)栽培大豆遺傳多樣性所需SSR引物的數(shù)目[J];分子植物育種;2003年01期

4 趙尚敏;白晨;張惠忠;牛素清;李曉東;付增娟;軒繼雨;李樹生;;適于甜菜遺傳多樣性分析的SSR引物篩選[J];中國(guó)糖料;2009年04期

5 崔秀敏;侯喜林;董玉秀;;ISSR-PCR和鏈親和素磁珠吸附法開(kāi)發(fā)白菜SSR引物[J];園藝學(xué)報(bào);2006年01期

6 吳根松;孫麗丹;張啟翔;潘會(huì)堂;蔡明;;基于近緣物種SSR引物和EST-SSR序列的梅花SSR引物開(kāi)發(fā)[J];北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年05期

7 關(guān)玲;黃金鳳;劉金義;高志紅;章鎮(zhèn);喬玉山;;基于蘋果基因組開(kāi)發(fā)梨的多態(tài)性SSR引物[J];西北植物學(xué)報(bào);2012年01期

8 聶瓊;劉仁祥;;同科植物SSR引物在煙草遺傳差異分析中的應(yīng)用研究[J];中國(guó)煙草科學(xué);2011年02期

9 陳軍方,任正隆,高麗鋒,賈繼增;從小麥EST序列中開(kāi)發(fā)新的SSR引物[J];作物學(xué)報(bào);2005年02期

10 高偉;王坤波;劉方;王春英;張香娣;王玉紅;黎紹惠;;SSR引物及多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)對(duì)陸地棉野生種系聚類結(jié)果的影響[J];植物遺傳資源學(xué)報(bào);2013年02期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 付飛;呂香玲;郭玉華;;玉米SSR引物在高粱中通用性研究[A];2010中國(guó)作物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2010年

2 鐘敏;程須珍;王麗俠;王素華;;綠豆基因組SSR引物的篩選及在遺傳連鎖圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用[A];中國(guó)作物學(xué)會(huì)50周年慶祝會(huì)暨2011年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2011年

3 季孔庶;李p，

本文編號(hào)：413504