CYP27A1是主要存在于肝臟中的一種細(xì)胞色素P450酶,是一種功能多樣且非常重要的CYP450酶。在人類體內(nèi),CYP27A1在維生素D₃的C-25位羥化過(guò)程以及膽汁酸合成中具有重要作用,是人類生命代謝中非常重要的酶。到目前為止,人們對(duì)人類維生素D羥化酶的研究已經(jīng)比較成熟,但是對(duì)禽類的維生素D羥化酶研究還非常有限,維生素D在雞的產(chǎn)蛋量、蛋殼硬度、骨骼強(qiáng)度以及孵化率等方面具有重要影響。因此研究雞體內(nèi)的維生素D羥化酶具有重要意義。經(jīng)研究分析后發(fā)現(xiàn),雞體內(nèi)的CYP27A1與人的CYP27A1同源性較高,且雞的CYP27A1也是雞體內(nèi)源及外源化合物代謝的關(guān)鍵羥化酶,由此推測(cè)雞體內(nèi)的CYP27A1可能參與維生素D₃的代謝。本實(shí)驗(yàn)選擇以雞的CYP27A1為研究對(duì)象,探究雞體內(nèi)的CYP27A1是否對(duì)維生素D₃具有羥化作用。在本研究中,首先采用了生物信息學(xué)軟件對(duì)雞的Cyp27a1編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析,對(duì)之后雞Cyp27a1的異源表達(dá)研究以及理化性質(zhì)研究提供參考。其次以雞Cyp27a1的cDNA序列為模板克隆了雞Cyp27a1基因的...

【文章頁(yè)數(shù)】：70 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 維生素D概述
        1.1.1 維生素D的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 維生素D的代謝與生理功能
        1.1.3 維生素D的病理學(xué)功能
        1.1.4 維生素D對(duì)雞的生理影響
    1.2 細(xì)胞色素P450酶概述
        1.2.1 細(xì)胞色素P450
        1.2.2 細(xì)胞色素P450分布及命名
        1.2.3 細(xì)胞色素P450代謝與功能
        1.2.4 細(xì)胞色素P450異源表達(dá)研究
    1.3 Cyp27a1概述
        1.3.1 參與維生素D的 25-羥基化作用的酶
        1.3.2 Cyp27a1分布與功能
        1.3.3 Cyp27a1的異源表達(dá)研究
        1.3.4 Cyp27a1的調(diào)控因素
        1.3.5 Cyp27a1引起的病理學(xué)作用
    1.4 本研究的目的及意義
第2章 雞CYP27A1的氨基酸序列分析
    2.1 方法
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 理化性質(zhì)分析
        2.2.2 親疏水性分析
        2.2.3 信號(hào)肽與跨膜信息分析
        2.2.4 亞細(xì)胞定位分析
        2.2.5 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)
        2.2.6 分子功能預(yù)測(cè)分析
        2.2.7 氨基酸序列比對(duì)
        2.2.8 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
        2.2.9 雞CYP27A1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
    2.3 討論
第3章 雞Cyp27a1的真核表達(dá)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌株與細(xì)胞
        3.1.2 儀器與設(shè)備
        3.1.3 主要試劑及材料
        3.1.4 主要試劑配制方法
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Cyp27a1的cDNA的PCR擴(kuò)增
        3.2.2 pcDNATM3.1/myc-His(-)A質(zhì)粒載體與Cyp27a1 PCR產(chǎn)物酶切
        3.2.3 Cyp27a1 PCR片段與pcDNATM3.1/myc-His(-)A載體連接
        3.2.4 篩選陽(yáng)性克隆
    3.3 293T細(xì)胞培養(yǎng)
        3.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇
        3.3.2 細(xì)胞傳代
        3.3.3 pcDNA-Cyp27a1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞
    3.4 Western Blotting檢測(cè)
        3.4.1 細(xì)胞中蛋白樣品的收集
        3.4.2 G250測(cè)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
        3.4.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)
    3.5 結(jié)果與分析
        3.5.1 Cyp27a1的cDNA擴(kuò)增
        3.5.2 Cyp27a1的PCR產(chǎn)物酶切
        3.5.3 菌液PCR檢測(cè)
        3.5.4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及蛋白濃度的測(cè)定
        3.5.5 雞CYP27A1真核表達(dá)蛋白的Western Blot檢測(cè)
    3.6 討論
第4章 酶活實(shí)驗(yàn)
    4.1 儀器設(shè)備
    4.2 試劑及材料
    4.3 試劑配制
    4.4 實(shí)驗(yàn)方法
        4.4.1 提取線粒體蛋白
        4.4.2 蛋白濃度測(cè)定
        4.4.3 酶活實(shí)驗(yàn)
    4.5 雞CYP27A1的生物活性檢測(cè)結(jié)果及分析
    4.6 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝



本文編號(hào)：3915415