發(fā)布時間：2017-05-24 06:17

  本文關(guān)鍵詞：豬源附紅細(xì)胞體分離鑒定PCR方法的建立及小附紅細(xì)胞體人工感染試驗，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：感染豬的附紅細(xì)胞體分為附紅細(xì)胞體和小附紅細(xì)胞體兩大類。而國內(nèi)還未見有關(guān)小附紅細(xì)胞體分離和動物感染試驗的報道。通過小附紅細(xì)胞體病原的分離鑒定及動物感染試驗,有助于了解小附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性及致病性。本試驗從上海地區(qū)2個屠宰場,采集豬抗凝血736份,提取血液基因組DNA作為模板,設(shè)計合成兩對特異性引物并驗證了具有高度敏感性和良好特異性,用兩對特異性的引物進(jìn)行16s RNA基因部分序列的PCR擴(kuò)增、克隆、序列測定及生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,在736份血樣中,豬源附紅細(xì)胞體陽性率為13.72%(101/756),其中小附紅細(xì)胞體陽性率為7.34%(54/736),豬附紅細(xì)胞體陽性率為4.76%(35/736),混合感染比例為1.63%(12/736),2個屠宰場3次采集的樣品陽性率差異極顯著(χ2==132.841,P0.001)。嘉定區(qū)某屠宰場3月份的陽性率為2.41%,5月份的陽性率為33.21%,5月份極顯著高于3月份(χ2=81.484,P0.001)。在DNA擴(kuò)增陽性血樣中,分別選取4份小附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增產(chǎn)物和4份豬附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增產(chǎn)物,亞克隆到pMD18-T載體后進(jìn)行測序。小附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段序列完全一致,長度均為483 bp, BLASTn軟件在線分析顯示所獲得序列與GenBank公布的小附紅細(xì)胞體Indiana株16S rRNA基因(登錄號：NR 121759)序列同源性達(dá)100%。豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段序列也完全一致,長度均為482 bp, BLASTn軟件在線分析顯示所獲得序列與GenBank公布的豬附紅細(xì)胞體Morioka5、6、8株16SrRNA基因(登錄號分別為：AB610847、AB610848、AB610849)和ZJ NB01株16S rRNA基因(登錄號：KC907396.1)序列同源性達(dá)100%,豬附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段與小附紅細(xì)胞體擴(kuò)增片段的同源性僅為93.6%。用小附紅細(xì)胞體陽性血樣通過肌肉注射方法接種廣西巴馬去脾仔豬,采集血樣進(jìn)行特異性PCR檢測及序列分析。結(jié)果表明：試驗組5頭仔豬中有2頭在接種12d、5頭在接種15d均檢出小附紅細(xì)胞體基因,人工感染豬血樣與接種原血樣DNA擴(kuò)增產(chǎn)物基因序列完全一致。這證明已經(jīng)成功建立了小附紅細(xì)胞體人工感染豬的試驗。本研究通過試驗數(shù)據(jù)證明了國內(nèi)確實有豬感染小附紅細(xì)胞體,小附紅細(xì)胞體和豬附紅細(xì)胞體在16sRNA基因片段上存在差異。通過人工肌肉接種,首次建立了小附紅細(xì)胞體豬感染試驗?zāi)Ｐ?為小附紅細(xì)胞體的生物學(xué)特性和致病性研究打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬源附紅細(xì)胞體 小附紅細(xì)胞體 豬附紅細(xì)胞體 16sRNA基因 特異性PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文縮略表7-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-22
• 1 豬源附紅細(xì)胞體病原學(xué)研究進(jìn)展11-14
• 1.1 病原分類11-12
• 1.2 病原形態(tài)及分布12-13
• 1.3 增殖13-14
• 2 豬附紅細(xì)胞體流行病學(xué)研究概述14
• 3 附紅細(xì)胞體病診斷手段的研究進(jìn)展14-20
• 3.1 形態(tài)學(xué)診斷14
• 3.2 血清學(xué)診斷14-17
• 3.3 分子生物學(xué)檢測17-20
• 4 小附紅細(xì)胞體的研究概述20
• 5 研究目的意義20-22
• 第二章 豬源附紅細(xì)胞體PCR檢測方法的建立22-29
• 1 實驗材料22-23
• 1.1 陽性質(zhì)粒DNA22
• 1.2 酶及試劑22
• 1.3 主要儀器22-23
• 2 實驗方法23-24
• 2.1 特異性引物設(shè)計23
• 2.2 特異性試驗23
• 2.3 敏感性試驗23-24
• 3 試驗結(jié)果24-27
• 3.1 特異性試驗24-25
• 3.2 敏感性試驗25-27
• 4 討論27-28
• 5 小結(jié)28-29
• 第三章 上海地區(qū)豬源附紅細(xì)胞體流行病學(xué)調(diào)查29-41
• 1 實驗材料29-31
• 1.1 豬血液樣品29
• 1.2 主要藥品及試劑29-31
• 1.3 主要器材31
• 2 實驗方法31-34
• 2.1 提取豬全血基因組DNA31-32
• 2.2 兩種豬源附紅細(xì)胞體的特異基因擴(kuò)增32-33
• 2.3 兩種豬源附紅細(xì)胞體引物擴(kuò)增陽性產(chǎn)物的純化(膠回收)33
• 2.4 兩種豬源附紅細(xì)胞體16S rRNA部分目的基因克隆33-34
• 2.5 兩種豬源附紅細(xì)胞體16SrRNA目的基因的鑒定(菌液PCR)34
• 3 結(jié)果34-39
• 3.1 兩種豬源附紅細(xì)胞體16SrRNA的特異性引物擴(kuò)增結(jié)果34-35
• 3.2 兩種豬源附紅細(xì)胞體16SrRNA的目的基因的鑒定35-36
• 3.3 測序結(jié)果及NCBI在線BLASR比對36-38
• 3.4 上海地區(qū)豬源附紅細(xì)胞體流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果38-39
• 4 討論39-40
• 5 小結(jié)40-41
• 第四章 小附紅細(xì)胞體人工感染豬模型初步建立41-50
• 1 實驗材料41-43
• 1.1 豬小附紅細(xì)胞體陽性血液樣品制備41
• 1.2 實驗動物41
• 1.3 主要試劑41-42
• 1.4 主要儀器42-43
• 2 試驗方法43-44
• 2.1 預(yù)試驗43
• 2.2 試驗動物分組及處理43
• 2.3 檢測指標(biāo)43-44
• 2.4 血液基因組的提取44
• 2.5 PCR檢測44
• 3 試驗結(jié)果44-48
• 3.1 臨床癥狀44
• 3.2 姬姆薩染色結(jié)果44-46
• 3.3 血液PCR檢測46-48
• 4 討論48-50
• 全文結(jié)論50-51
• 本實驗的創(chuàng)新點51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58-59
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文59

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉思國,康麗娟,江國托,孔憲剛,劉忠貴,韓業(yè)超,盧景良;PCR方法快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2000年S1期

2 劉澤文,邵華斌,楊峻,汪宏才,段正贏,熊忠良,王紅琳;應(yīng)用PCR方法檢測雞傳染性貧血病毒[J];湖北畜牧獸醫(yī);2004年04期

3 黃鸝;李偉豐;;用復(fù)合PCR方法鑒定水稻品種的真實性[J];種子科技;2007年01期

4 施少華;程龍飛;傅光華;陳紅梅;萬春和;陳珍;彭春香;黃瑜;;檢測禽多殺性巴氏桿菌PCR方法的建立[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2009年03期

5 王哲;陳青;田茜;李志紅;朱水芳;趙文軍;;應(yīng)用PCR方法快速檢測黃瓜細(xì)菌性角斑病菌[J];植物檢疫;2011年06期

6 劉思國,江國托,康麗娟,劉明春,劉忠貴,盧景良;PCR方法快速檢測雞傳染性支氣管炎病毒[J];動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;1999年03期

7 楊兵,徐福洲,王金洛,陳小玲,孟彥妮;應(yīng)用PCR方法檢測雞傳染性貧血病毒[J];華北農(nóng)學(xué)報;2003年03期

8 姚四新;趙淑秋;王憲文;王麗榮;趙樸;陳仕鈞;張兆沛;王青;劉興友;劉金華;;應(yīng)用隨機(jī)PCR方法鑒定一株真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌[J];生物技術(shù)通報;2010年12期

9 張紅梅;PCR方法診斷雞傳染性喉氣管炎病毒的研究　[J];濟(jì)寧師專學(xué)報;2001年06期

10 羅金燕;陳磊;秦萌;趙玉強(qiáng);余慧;;免疫捕捉PCR和經(jīng)典PCR方法檢測水稻細(xì)菌性谷枯病菌靈敏性比較[J];浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報;2014年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊兵;徐福洲;陳小玲;;應(yīng)用PCR方法檢測雞傳染性貧血病毒[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2002年

2 王英杰;王長法;高運(yùn)東;仲躋峰;安利國;楊桂文;陳營;楊宏軍;;應(yīng)用雙重PCR方法對奶牛乳腺炎金葡菌溶血毒素進(jìn)行分型[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會成立大會暨第一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

3 田克恭;趙鐵柱;蘇建青;李純玲;孫明;;用PCR方法對北京地區(qū)不同年代犬細(xì)小病毒分離株的分型鑒定研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2004年

4 張安云;王紅寧;周萬蓉;柳萍;黃勇;楊鑫;夏青青;劉立;;用四重PCR方法檢測野生動物分離細(xì)菌對氨基糖苷類藥物的耐藥基因[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第十二次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

5 金超;;牛瑟氏泰勒蟲不同靶基因PCR方法的比較[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

6 王明彪;林子清;宋琳;董玉貞;王寧;朱敏;楊洪波;;用PCR方法判定指紋性別的研究[A];加入WTO和中國科技與可持續(xù)發(fā)展——挑戰(zhàn)與機(jī)遇、責(zé)任和對策（下冊）[C];2002年

7 安燁;龔玉梅;Jeanette Miflin;Pat Blackall;孫惠玲;張培君;;肉芽腫曼氏桿菌PCR方法的研究[A];微生物與人類健康科技論壇論文匯編[C];2009年

8 王英;湯承;于學(xué)輝;王遠(yuǎn)微;岳華;;檢測產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的四重PCR方法的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會成立大會暨第一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

9 楊霞;孫彥婷;王新衛(wèi);常洪濤;劉紅英;姚慧霞;王川慶;;鑒別豬瘟和非洲豬瘟病毒復(fù)合PCR方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

10 劉寶明;李彤;董建平;胥婕;李曉光;嚴(yán)平;王鳳水;閆玲;李文鵬;金暉;楊靖嫻;莊輝;;A～D基因型乙型肝炎病毒全長逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)PCR方法的建立及應(yīng)用[A];微生物與人類健康科技論壇論文匯編[C];2009年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 雷曉思;豬源附紅細(xì)胞體分離鑒定PCR方法的建立及小附紅細(xì)胞體人工感染試驗[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 鄭江霞;PCR方法鑒別奶牛胚胎性別相關(guān)環(huán)節(jié)的優(yōu)化研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

3 姜麗娟;利用熒光定量RT-PCR和PCR方法檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群[D];復(fù)旦大學(xué);2011年

4 尹雪琴;鴨瘟病毒UL2基因的原核表達(dá)及鑒別鴨瘟病毒強(qiáng)弱毒株P(guān)CR方法的建立[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

5 黃蓉;PCR方法測定尖銳濕疣疑似患者HPV的結(jié)果分析[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2013年

  本文關(guān)鍵詞：豬源附紅細(xì)胞體分離鑒定PCR方法的建立及小附紅細(xì)胞體人工感染試驗，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：390005