利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行定向基因編輯,創(chuàng)造新型種質(zhì)資源已經(jīng)在多種重要作物中得到成功的運(yùn)用。在甘藍(lán)型油菜中,多室性狀能夠增加每角果粒數(shù)從而達(dá)到增產(chǎn)目的,但是在自然條件下還沒有發(fā)現(xiàn)多室突變體。根據(jù)模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)的多室角果形成的相關(guān)途徑和基因。我們挑選了甘藍(lán)型油菜中的Bna CLV1、Bna CLV2、Bna CLV3和Bna RPK2作為甘藍(lán)型油菜的多室候選靶基因,設(shè)計它們的CRISPR/Cas9編輯載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)建這些候選基因的突變體。在此基礎(chǔ)上,一方面可以確定這些基因功能,另一方面也可以創(chuàng)建多室突變體,為油菜的高產(chǎn)育種提供新的種質(zhì)資源。主要結(jié)果如下:1.生物信息學(xué)分析表明,甘藍(lán)型油菜中Bna CLV1、Bna CLV2、Bna CLV3和Bna RPK2基因的結(jié)構(gòu)和擬南芥的同源基因基本相同。根據(jù)這些基因的結(jié)構(gòu),我們針對各個候選基因設(shè)計了2-4個靶位點(diǎn),構(gòu)建了它們的多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法分別獲得了119、40、319和108株Bna CLV1、Bna CLV2、Bna CLV3和Bna RPK2的T0代轉(zhuǎn)基因... 

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
1 前言
    1.1 多室油菜的研究進(jìn)展
        1.1.1 多室油菜的種類及表型特征
        1.1.2 多室油菜的遺傳及其基因定位
        1.1.3 模式植物擬南芥中多室性狀的分子調(diào)控機(jī)理
    1.2 基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展
        1.2.1 主要基因編輯技術(shù)簡介
        1.2.2 細(xì)菌中CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的簡介
            1.2.2.1 CRISPR/Cas基因座的結(jié)構(gòu)
            1.2.2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類
            1.2.2.3 CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的工作原理
        1.2.3 人工合成的CRISPR/Cas9系統(tǒng)
            1.2.3.1 Cas9蛋白
            1.2.3.2 導(dǎo)向RNA
            1.2.3.3 PAM元件
            1.2.3.4 CRISPR/Cas9的工作原理
        1.2.4 CRISPR/Cas9與其他基因編輯技術(shù)的比較
        1.2.5 CRISPR/Cas9編輯的檢測方法
        1.2.6 CRISPR/Cas9基因編輯的類型和突變效率
        1.2.7 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在植物中的應(yīng)用
    1.3 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 轉(zhuǎn)化載體
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 主要試劑的配方
            2.1.4.1 油菜遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基
            2.1.4.2 DNA提取相關(guān)試劑
            2.1.4.3 非變性PAGE膠相關(guān)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
        2.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化與陽性鑒定
            2.2.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化
            2.2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定
        2.2.3 轉(zhuǎn)基因陽性植株的編輯檢測和測序
            2.2.3.1 基于PAGE的編輯檢測
            2.2.3.2 PCR產(chǎn)物測序
            2.2.3.3 PCR產(chǎn)物克隆測序
        2.2.4 轉(zhuǎn)基因油菜的種植
        2.2.5 多室性狀考察
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 多室候選基因結(jié)構(gòu)分析
    3.2 多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建
    3.3 CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)基因植株的陽性鑒定結(jié)果
    3.4 甘藍(lán)型油菜中CRISPR/Cas9的編輯效率
    3.5 突變的類型
    3.6 突變的遺傳
    3.7 突變表型
4 討論
    4.1 多靶點(diǎn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在油菜中的運(yùn)用
    4.2 多靶點(diǎn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)在甘藍(lán)型油菜中的突變特點(diǎn)
    4.3 甘藍(lán)型油菜的多室基因
    4.4 存在問題
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]擬南芥莖尖干細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 崔玉超,陳亮.  廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2016(06)
[2]芥菜型油菜多室基因Bjmc2的精細(xì)定位[J]. 王剛,張向向,徐平,呂澤文,文靜,易斌,馬朝芝,涂金星,傅廷棟,沈金雄.  作物學(xué)報. 2016(12)
[3]甘藍(lán)型油菜三棱角自交群體的角果性狀[J]. 朱彥濤,田建華.  中國油料作物學(xué)報. 2015(05)
[4]芥菜型油菜多室角果的解剖特征及遺傳分析[J]. 呂澤文,徐平,張向向,文靜,易斌,馬朝芝,涂金星,傅廷棟,沈金雄.  中國油料作物學(xué)報. 2012(05)
[5]我國油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的歷史回顧與展望[J]. 王漢中.  中國油料作物學(xué)報. 2010(02)
[6]甘藍(lán)型三棱角油菜新材料的遺傳與選育研究初報[J]. 朱彥濤.  西北農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2005(01)
[7]多心皮油菜的植物學(xué)特征及意義[J]. 代秉勛,李加納,沈顯生,戴秉益,王平,朱祥文.  作物研究. 2004(01)
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[9]白菜型油菜角果多室性狀的遺傳及解剖學(xué)研究[J]. 何余堂,龍衛(wèi)華,胡進(jìn)平,傅廷棟,李殿榮,陳寶元,涂金星.  中國油料作物學(xué)報. 2003(01)
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碩士論文
[1]白菜型油菜多室基因BrCLV3的功能研究[D]. 武語笛.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[2]芥菜型油菜多室性狀的遺傳表現(xiàn)及其與甘藍(lán)型油菜的種間遠(yuǎn)緣雜交[D]. 趙洪朝.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2003



本文編號：3734257