布魯氏菌病（Brucellosis,簡(jiǎn)稱(chēng)“布病”）是由胞內(nèi)寄生菌——布魯氏菌（Brucella spp.）引起的一種人獸共患傳染病,該病嚴(yán)重影響我國(guó)的畜牧業(yè)的發(fā)展,造成重大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)目前對(duì)布魯氏菌病的檢測(cè)主要以細(xì)菌學(xué)、血清學(xué)檢測(cè)方法為主,這些方法存在著費(fèi)時(shí)費(fèi)力、假陽(yáng)性、以及無(wú)法區(qū)分死菌等缺點(diǎn),同時(shí)不能對(duì)病原進(jìn)行快速檢測(cè)和種間鑒定。因此,開(kāi)發(fā)布魯氏菌病快速檢測(cè)方法對(duì)布病的防控與凈化具有重要意義。本課題致力于研究布魯氏菌的快速檢測(cè)方法,以核酸擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ),建立一系列檢測(cè)方法,為布魯氏菌病的科學(xué)研究、防控與凈化,提供切實(shí)有效的布魯氏菌檢測(cè)技術(shù)手段。1、通過(guò)將疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide,PMA）與熒光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR,qPCR）結(jié)合建立一種布魯氏菌活菌數(shù)的快速定量檢測(cè)方法。以布魯氏菌單拷貝BCSP31基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo),構(gòu)建重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。優(yōu)化qPCR反應(yīng)條件及PMA最佳應(yīng)用濃度與曝光時(shí)間,對(duì)該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,CT值與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒拷貝數(shù)濃度對(duì)數(shù)值之間線(xiàn)性關(guān)系良好;靈敏度為... 

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【部分圖文】：

Bruce-ladder法對(duì)布魯氏菌進(jìn)行種間鑒定[85]

第一篇文獻(xiàn)綜述第2章基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法及其應(yīng)用16基團(tuán)，對(duì)整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，將每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)、收集，最終利用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣本進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍。該技術(shù)目前常用的熒光物質(zhì)主要分為探針類(lèi)和染料類(lèi)兩大類(lèi)。1）TaqMan探針TaqMan探針是一段能與目的片段特異結(jié)合的核酸序列，如圖2所示，該序列的5"標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)，3"端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針處于完整狀態(tài)時(shí)，熒光基團(tuán)所釋放的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收。當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，引物與探針都與模板鏈特異性結(jié)合，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的開(kāi)始，探針鏈逐漸被鏈置換反應(yīng)所替代，探針將會(huì)被DNA聚合酶的5"-3"外切酶活性所水解，此時(shí)熒光基團(tuán)釋放的熒光信號(hào)就會(huì)隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行被儀器監(jiān)測(cè)。熒光信號(hào)的強(qiáng)度達(dá)到儀器所設(shè)置的某一閾值時(shí)，此時(shí)的循環(huán)次數(shù)（CT值）就被記錄下來(lái)，CT值與目的基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值成線(xiàn)性關(guān)系，從而對(duì)目標(biāo)物達(dá)到定量的目的[98]。圖2TaqMan探針技術(shù)作用原理[99]Fig.2TheprincipleofTaqManProbetechnology2）雜交探針（HybProbe）雜交探針是由兩個(gè)寡核苷酸探針?biāo)M成，該探針率先由羅氏公司（Roche）所發(fā)明并應(yīng)用于熒光定量PCR的檢測(cè)。如圖3所示，兩個(gè)寡核苷酸探針?lè)謩e標(biāo)記熒光供體和熒光受體，當(dāng)PCR反應(yīng)退火復(fù)性時(shí)，兩個(gè)探針同與一條模板鏈進(jìn)行雜交，熒光供體與熒光受體相接近，熒光供體被外來(lái)光源激發(fā)，其釋放的能量

第一篇文獻(xiàn)綜述第2章基于核酸擴(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)方法及其應(yīng)用17通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）傳遞給熒光受體，而受體所釋放的熒光信號(hào)則被儀器檢測(cè)到，隨著擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，DNA產(chǎn)物越多，其釋放的熒光信號(hào)就越大，從而對(duì)目標(biāo)物達(dá)到定量的目的圖3雜交探針技術(shù)作用原理（引自Roche公司）Fig.3TheprincipleofHybridizationProbetechnology3）分子信標(biāo)探針（MulecularBeaconsProbe）分子信標(biāo)探針為新型探針，該探針需要特定結(jié)構(gòu)的序列，設(shè)計(jì)要求高。特點(diǎn)在于其為莖環(huán)狀的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如圖4所示。該探針的莖環(huán)是由15~30個(gè)核苷酸組成，莖臂一般由5~7個(gè)核苷酸組成，其兩端序列互補(bǔ)配對(duì)，分別標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅集團(tuán)。當(dāng)無(wú)靶標(biāo)時(shí)，探針成自由狀態(tài)，形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)被激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)被淬滅集團(tuán)所淬滅，當(dāng)探針與模板鏈成功雜交時(shí)，可形成線(xiàn)性結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)間隔較遠(yuǎn)，淬滅基團(tuán)失去作用，此時(shí)所激發(fā)的熒光信號(hào)可被儀器監(jiān)測(cè)到。圖4分子信標(biāo)探針技術(shù)作用原理（引自Roche公司）Fig.4TheprincipleofMulecularBeaconsProbetechnology4）熒光染料熒光染料的工作原理較簡(jiǎn)單，如圖5所示，當(dāng)熒光染料與雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，進(jìn)而被儀器監(jiān)測(cè)到，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與反應(yīng)體系內(nèi)

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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