本文關(guān)鍵詞：龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達(dá)分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：龍眼(Dimocarpus longan Lour.),屬于無(wú)患子科(Sapindaceae)龍眼屬(Dimocarpus Lour.)常綠木本植物,龍眼胚胎發(fā)育的研究對(duì)于龍眼的生產(chǎn)具有重要的意義。植物體胚發(fā)育過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,存在著許多代謝途徑和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),miRNA作為重要的調(diào)控因子植物體胚發(fā)生過(guò)程中一定存在著巨大的作用,與miRNA相互作用的AGO蛋白在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中也具有重要的作用。本研究擬通過(guò)對(duì)AGO家族基因進(jìn)行克隆,以及熒光定量PCR技術(shù)對(duì)龍眼體胚發(fā)生不同階段以及四季密龍眼不同組織的中AGO基因的表達(dá)量進(jìn)行分析,同時(shí)對(duì)其亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究,為揭示龍眼miRNA調(diào)控分子機(jī)制提供新的線索,并為調(diào)控龍眼等木本植物的胚胎發(fā)育提供理論依據(jù)。1龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全長(zhǎng)克隆通過(guò)對(duì)龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組分析和GeneBank中的比對(duì),龍眼胚性愈傷組織中含有5種AGO蛋白,分別為AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO6,其中AG04基因的表達(dá)量極低。在此基礎(chǔ)上,利用RT-PCR和RACE技術(shù),對(duì)AGO1、AGO2、AGO5、AGO6進(jìn)一步克隆,最終獲得它們的cDNA全長(zhǎng)序列：AGO1基因cDNA全長(zhǎng)為3529 bp,開放閱讀框?yàn)?183 bp,編碼1061個(gè)氨基酸,命名為DlAGO1, GeneBank登錄號(hào)為KM001869; AGO2基因全長(zhǎng)為3128 bp,5端UTR長(zhǎng)度為73 bp,3端UTR長(zhǎng)度為121 bp,開放閱讀框?yàn)?934bp(含終止子),編碼976個(gè)氨基酸,命名為DlAG02,登錄號(hào)為KM001870; AGO5基因的全長(zhǎng)為3203 bp,開放閱讀框?yàn)?919 bp,編碼972個(gè)氨基酸,命名為DlAG05,登錄號(hào)為KM001871；龍眼胚性愈傷組織AG06基因cDNA的全長(zhǎng)序列3168 bp,開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為2700 bp,編碼900個(gè)氨基酸,命名為DlAGO6,登錄號(hào)為KF819529。2龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息學(xué)分析在上述基礎(chǔ)上,利用生物信息學(xué)對(duì)龍眼胚性愈傷組織AGO基因家族的基因進(jìn)行基本理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域等進(jìn)行分析。對(duì)龍眼胚性愈傷組織中AGO1、AGO2、AGO5和AG06基因編碼的氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示,DLAGO2 PIWI區(qū)域含有DDD結(jié)構(gòu),DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6含有DDH結(jié)構(gòu),由此推測(cè)龍眼胚性愈傷組織的AGO1、AGO2、AGO5、AGO6蛋白可能具有切割mRNA功能,參與轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默。磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6蛋白絲氨酸磷酸化位點(diǎn)較多并N、C兩端分布密集,中間部分分布均勻,AGO蛋白的PIWI結(jié)構(gòu)域具有RNA內(nèi)切酶活性,而該蛋白豐富的絲氨酸磷酸化位點(diǎn),可能為增加該蛋白與小RNA結(jié)合后的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控作用。DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6與擬南芥、水稻、葡萄AGO蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織的AGO蛋白可能分為四個(gè)分支,并且DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5和DlAGO6分別屬于龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白的四個(gè)分支。3龍眼體胚發(fā)生過(guò)程以及龍眼不同組織器官中AGO1、AGO2、 AGO5和AGO6基因家族的表達(dá)定量分析用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中以及不同組織器官中進(jìn)行相對(duì)定量表達(dá)分析。龍眼不同胚性階段的表達(dá)情況：在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程早期,隨著體胚發(fā)生過(guò)程的推進(jìn),AGO1基因的表達(dá)量逐漸升高,在子葉時(shí)期的表達(dá)量有所降低,整體來(lái)看在非胚性階段的時(shí)候表達(dá)量是最高的；AGO2基因在龍眼的不同胚性階段的表達(dá)量具有差異,從整體趨勢(shì)來(lái)說(shuō),相對(duì)表達(dá)量的趨勢(shì)呈M型,在愈傷組織和球形胚時(shí)期的表達(dá)量是M型的兩個(gè)頂點(diǎn),在非胚性階段、不完全緊實(shí)結(jié)構(gòu)以及子葉胚時(shí)期表達(dá)量相對(duì)較低；AGO5基因在龍眼體胚的不同階段的表達(dá)具有顯著的差異,整體的呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),隨著體胚發(fā)生過(guò)程的推進(jìn),AGO5基因的表達(dá)逐漸降低,非胚性階段的表達(dá)量高于其它胚性階段；AGO6基因在龍眼體胚的不同階段的表達(dá)具有顯著的差異,整體的呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),隨著體胚發(fā)生過(guò)程的推進(jìn),AGO6基因的表達(dá)逐漸降低,但非胚性愈傷組織中的表達(dá)量相對(duì)低很多。龍眼不同組織部位的表達(dá)情況：AGO基因在龍眼不同組織部位中的表達(dá)具有差異顯著,其中AGO1基因在葉、花蕾、小果、大果、果皮以及種子中的表達(dá)量相對(duì)較低,在果肉中的相對(duì)表達(dá)量最高,可能與果肉的形成有關(guān),另外在成花和根中的相對(duì)表達(dá)量同樣較高的,因此AGO1基因可能與花和根的發(fā)育相關(guān)miRNA具有相互作用關(guān)系；AGO2基因在根、葉、花蕾、成花、小果、大果、果肉、種子的表達(dá)量相對(duì)較低,在果皮內(nèi)的含量很高,推測(cè)AGO2基因與果皮的發(fā)育有關(guān)的miRNA具有相互作用。AGO5基因果皮中的表達(dá)量顯著高于其他組織部位,這個(gè)與AGO2基因相似,可能與AGO2基因有相互作用關(guān)系；AGO5基因在小果中的表達(dá)量極低,在大果中表達(dá)量也不高,卻在果皮中表達(dá)量高,推測(cè)可能在果實(shí)成熟后期的果皮發(fā)育過(guò)程中具有重要作用；AGO6基因成花與果肉的表達(dá)最高,在葉、大果、果皮的表達(dá)量相對(duì)較低,在根和花蕾相對(duì)表達(dá)量較高,小果和種子的相對(duì)表達(dá)量高于葉等的組織部位。4龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亞細(xì)胞定位分析本研究過(guò)程中構(gòu)建了龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6蛋白的亞細(xì)胞定位載體,采用了農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),于洋蔥表皮細(xì)胞中觀察AGO1、AGO2、AGO5和AGO6亞細(xì)胞定位熒光信號(hào),結(jié)果顯示,AGO1主要在細(xì)胞核和微體中,AGO2主要集中于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,AGO5和AGO6主要集中于細(xì)胞核和細(xì)胞膜上。龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白都定位于細(xì)胞核中,細(xì)胞核是生物體遺傳物質(zhì)以及核糖體合成的主要場(chǎng)所,對(duì)于細(xì)胞周期以及細(xì)胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的亞細(xì)胞定位的研究,有助于進(jìn)一步探究基因功能。綜上所述,通過(guò)龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的序列和生物信息學(xué)分析,可以發(fā)現(xiàn)龍眼胚性愈傷組織AGO基因家族序列保守性較強(qiáng),是一類保守的堿性蛋白,且龍眼AGO蛋白可以分為與水稻類似的四個(gè)分支。AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的差異表達(dá),推測(cè)可能與細(xì)胞分裂速率有關(guān),并在四季蜜不同組織中的差異表達(dá),推測(cè)其可能參與特定器官的形態(tài)建成。亞細(xì)胞定位顯示AGO1、AGO2、AGO5和AGO6均定位于細(xì)胞核中。細(xì)胞核是生物體遺傳物質(zhì)以及核糖體合成的主要場(chǎng)所,對(duì)于細(xì)胞周期以及細(xì)胞衰老都具有重要功能,AGO蛋白的克隆、生物信息學(xué)分析、表達(dá)分析及亞細(xì)胞定位的研究,有助于進(jìn)一步探究該基因的功能。
【關(guān)鍵詞】：龍眼 體胚發(fā)生 AGO 基因克隆 定量PCR 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S667.2
【目錄】：

• 縮寫詞9-10
• 摘要10-13
• Abstract13-17
• 第一章 引言17-27
• 1 植物體胚發(fā)生研究進(jìn)展18-19
• 2 植物miRNA研究進(jìn)展19-21
• 2.1 植物miRNA起源19-20
• 2.2 植物miRNA生物合成過(guò)程20
• 2.3 植物miRNA的調(diào)控作用機(jī)制20-21
• 2.4 植物miRNA的鑒定21
• 3 植物AGO蛋白的研究進(jìn)展21-24
• 3.1 AGO蛋白的分類22
• 3.2 AGO蛋白的功能22-23
• 3.3 AGO蛋白的功能結(jié)構(gòu)域23-24
• 3.4 AGO蛋白與miRNA結(jié)合的影響因素24
• 4 龍眼體胚發(fā)生的分子生物學(xué)研究進(jìn)展24-25
• 5 本研究的意義及主要研究?jī)?nèi)容25-27
• 5.1 本研究的意義25-26
• 5.2 本研究的主要內(nèi)容26-27
• 第二章 龍眼胚性愈傷組織AGO家族基因cDNA全長(zhǎng)克隆27-49
• 1 材料與方法28-30
• 1.1 供試材料28
• 1.2 方法28-30
• 1.2.1 總RNA提取及cDNA的合成28
• 1.2.2 龍眼胚性愈傷組織AGO基因轉(zhuǎn)錄組分析28
• 1.2.3 引物設(shè)計(jì)28
• 1.2.4 目的片段擴(kuò)增28-30
• 1.2.5 目的片段回收、TA克隆和測(cè)序30
• 1.2.6 序列拼接30
• 2 結(jié)果與分析30-47
• 2.1 龍眼胚性愈傷組織基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析30
• 2.2 龍眼胚性愈傷組織jca?基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆30-35
• 2.3 龍眼胚性愈傷組織AGO2基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆35-39
• 2.4 龍眼胚性愈傷組織AGO5基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆39-43
• 2.5 龍眼胚性愈傷組織AGO6基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆43-47
• 3 討論47-49
• 3.1 龍眼胚性愈傷組織AGO基因是保守性蛋白47
• 3.2 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因克隆意義47-49
• 第三章 龍眼胚性愈傷組織AGO家族基因的生物信息學(xué)分析49-72
• 1 材料和方法49
• 1.1 材料49
• 1.2 方法49
• 2 結(jié)果與分析49-70
• 2.1 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析49-51
• 2.2 蛋白的信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)51-53
• 2.3 蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)53-55
• 2.4 蛋白質(zhì)磷酸化結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)55-58
• 2.5 蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)58-59
• 2.6 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征分析59
• 2.7 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析59-66
• 2.8 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析66-68
• 2.9 龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白中AGO1、AGO2、AGO5以及AGO6的系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建68-70
• 3 討論70-72
• 3.1 龍眼胚性愈傷組織DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6蛋白能具有切割mRNA功能,參與轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默70-71
• 3.2 龍眼胚性愈傷組織DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6絲氨酸磷酸化位點(diǎn)含量豐富,推測(cè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)作用相關(guān)71
• 3.3 龍眼胚性愈傷組織DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6進(jìn)化樹分析,推測(cè)龍眼胚性愈傷組織AGO蛋白分為四個(gè)分支71-72
• 第四章 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程以及龍眼不同組織器官中AGO基因家族的表達(dá)定量分析72-82
• 1 材料與試劑72-74
• 1.1 材料72
• 1.2 主要試劑和儀器72
• 1.3 方法72-74
• 1.3.1 龍眼體胚發(fā)生不同階段材料總RNA提取及cDNA合成72-73
• 1.3.2 引物設(shè)計(jì)73
• 1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR73-74
• 1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定74
• 2 結(jié)果與分析74-79
• 2.1 龍眼AGO1基因的差異表達(dá)分析74-76
• 2.1.1 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中AGO1基因的差異表達(dá)74-75
• 2.1.2 龍眼不同組織部位AGO1基因的差異表達(dá)75-76
• 2.2 龍眼AGO2基因的差異表達(dá)分析76-77
• 2.2.1 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中AGO2基因的差異表達(dá)76
• 2.2.2 龍眼不同組織部位AGO2基因的差異表達(dá)76-77
• 2.3 龍眼AGO5基因的差異表達(dá)分析77-78
• 2.3.1 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中AGO5基因的差異表達(dá)77-78
• 2.3.2 龍眼不同組織部位AGO5基因的差異表達(dá)78
• 2.4 龍眼AGO6基因的差異表達(dá)分析78-79
• 2.4.1 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中AGO6基因的差異表達(dá)78-79
• 2.4.2 龍眼不同組織部位AGO6基因的差異表達(dá)79
• 3 討論79-82
• 3.1 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5、AGO6在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的差異表達(dá),推測(cè)可能與細(xì)胞分裂速率有關(guān)79-80
• 3.2 AGO1、AGO2、AGO5、AGO6在四季蜜不同組織中的差異表達(dá),可能參與特定器官的形態(tài)建成80-82
• 第五章 龍眼AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的亞細(xì)胞定位分析82-89
• 1 材料與試劑82
• 1.1 菌株與載體82
• 1.2 受體材料82
• 1.3 生化試劑82
• 1.4 儀器設(shè)備82
• 2 實(shí)驗(yàn)方法82-85
• 2.1 總RNA的提取以及cDNA的合成82-83
• 2.2 基因序列分析83
• 2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成83
• 2.4 候選基因的PCR擴(kuò)增83-84
• 2.5 載體酶切84
• 2.6 重組質(zhì)粒并鑒定84
• 2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌84-85
• 2.8 瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化洋蔥表皮以及顯微觀察85
• 3 結(jié)果與分析85-88
• 3.1 AGO蛋白信號(hào)肽序列分析以及核定位信號(hào)分析85-86
• 3.2 龍眼AGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建86-87
• 3.3 龍眼愈傷組織cDNAAGO1、AGO2、AGO5、AGO6基因的亞細(xì)胞定位共聚焦觀察分析87-88
• 4 討論88-89
• 第六章 小結(jié)89-92
• 1 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因cDNA全長(zhǎng)克隆89-90
• 2 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因的生物信息學(xué)分析90
• 3 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程以及龍眼不同組織器官中AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的表達(dá)定量分析90-91
• 4 龍眼胚性愈傷組織AGO1、AGO2、AGO5和AGO6基因家族的亞細(xì)胞定位分析91-92
• 參考文獻(xiàn)92-100
• 附錄 GenBank上登錄的龍眼愈傷組字AGO基因家族的序列信息100-112
• 攻讀碩士期間發(fā)表論文、參加學(xué)術(shù)會(huì)議與獲獎(jiǎng)情況112-113
• 致謝113

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊曼曼;龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達(dá)分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：龍眼胚性愈傷組織AGO基因克隆與表達(dá)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：338995