豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起豬以腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病,可感染各個(gè)年齡段豬尤其對(duì)哺乳仔豬具有高度致死率,傳播方式主要是糞-口途徑,對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成很大危害。因此,分離TGEV可為該病的流行病學(xué)、生物學(xué)特征以及作為疫苗生產(chǎn)的后備毒株篩選奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究利用TGEV陽性豬糞便及小腸內(nèi)容物在PK-15細(xì)胞中進(jìn)行病毒分離,成功分離一株TGEV。該分離毒在盲傳10代時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變,通過對(duì)第15代分離毒進(jìn)行巢式RT-PCR,間接免疫熒光試驗(yàn),電鏡觀察的方法成功鑒定。測(cè)定病毒TCID₅₀為10^-5.25/0.1 mL。為了深入探究該毒株對(duì)仔豬的致病性,本試驗(yàn)對(duì)第15代分離毒經(jīng)口服的方式感染未吃母乳的3日齡仔豬進(jìn)行致病性分析。結(jié)果表明,攻毒組仔豬在感染12 h后陸續(xù)出現(xiàn)腹瀉癥狀;而對(duì)照組仔豬未見異常。臨床癥狀評(píng)分表明攻毒組仔豬在攻毒36 h與陰性對(duì)照組相比差異極顯著... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

TGEV基因組結(jié)構(gòu)圖

一株豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及其對(duì)仔豬致病性研究12沉淀用適量pH7.0溶液懸浮，磷鎢酸負(fù)染電鏡觀察結(jié)果。2.2.6病毒TCID50計(jì)算取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，使細(xì)胞長(zhǎng)滿單層進(jìn)行病毒接種。取編號(hào)十個(gè)1.5mL離心管，向每支離心管中加入900μL細(xì)胞培養(yǎng)液（100%DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，不含有胎牛血清），然后向1號(hào)離心管中加入100μL病毒液，將上述病毒液10倍倍比稀釋后接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每一稀釋度接種一縱排，共8孔，每孔100μL。在每孔加入細(xì)胞懸液100μL，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照作兩縱排。（100μL生長(zhǎng)液100μL細(xì)胞懸液）。將培養(yǎng)板放置于37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察并記錄出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)，在5%CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)3~5d。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算第15代病毒的TCID50[95]。2.3試驗(yàn)結(jié)果2.3.1樣品巢式RT-PCR鑒定結(jié)果為了明確分離樣本是TGEV陽性，將實(shí)驗(yàn)室保存的腹瀉樣品剪碎研磨處理，經(jīng)過RNA提取和反轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行巢式RT-PCR鑒定，結(jié)果顯示，出現(xiàn)了與預(yù)期長(zhǎng)度相符的目的片段。圖2-1腹瀉樣品TGEVN基因巢式RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig2-1TheinducedforTGEVpartialNgenebynestRT-PCRM.DL2000DNAMarker；1，2.外套擴(kuò)增產(chǎn)物；3，4.內(nèi)套擴(kuò)增產(chǎn)物；5.陰性對(duì)照LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1,2.Firstroundpositiveamplificationproducts;Lane3,4.Secondroundpositiveamplificationproducts;Lane5.Negativecontrol2.3.2分離毒CPE觀察將處理后的TGEV陽性病料接種于PK-15細(xì)胞培養(yǎng)60h，將細(xì)胞凍融三次繼續(xù)接種于PK-15細(xì)胞直至出現(xiàn)細(xì)胞病變。結(jié)果顯示在盲傳第10代60h首次出現(xiàn)CPE，但CPE不明顯，隨著代次增加CPE出現(xiàn)的時(shí)間縮短，當(dāng)盲傳到第15代48h時(shí)，可觀察到PK-15細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。主要表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮并形成合胞體，部分細(xì)胞有脫落現(xiàn)象，其細(xì)胞

豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定13病變形態(tài)為典型的TGEV感染細(xì)胞病變；而未接毒的細(xì)胞無細(xì)胞病變現(xiàn)象且細(xì)胞狀態(tài)良好。圖2-2TGEV分離株感染PK-15細(xì)胞48hCPE觀察Fig2-2Cytopathogeniceffect(CPE)inducedbyTGEVonPK-15cell48hA：未接毒的PK-15細(xì)胞；B:TGEV分離毒感染的PK-15細(xì)胞A：PK-15cellwithoutinoculatedbyTGEV.B：TheCPEofPK-15cellinducedbyTGEV2.3.3分離毒RT-PCR特異性檢測(cè)結(jié)果為了從核酸角度驗(yàn)證分離毒是TGEV，將第15代分離毒通過巢式RT-PCR鑒定，并用實(shí)驗(yàn)室已建立的方法與PEDV、PDCoV進(jìn)行共同檢測(cè)。結(jié)果顯示，分離毒泳道出現(xiàn)的片段與預(yù)期大小相符。其他豬腸道病毒均為陰性。說明只有TGEV在PK-15細(xì)胞中得到了增殖。圖2-3TGEV分離毒病原特異性RT-PCR鑒定結(jié)果Fig2-3RT-PCRspecificityidentificationofTGEVisolationstrainM.DL2000DNAMarker；1.TGEV檢測(cè)；2.陰性對(duì)照；3.PEDV檢測(cè)；4.PDCoV檢測(cè)LaneM.DL2000DNAmarker;Lane1.TGEVdetection;Lane2.Negativecontrol;Lane3.PEDVdetection；4.PEDVdetection2.3.4分離毒IFA鑒定結(jié)果通過IFA試驗(yàn)鑒定分離毒是TGEV，選擇第15代分離毒進(jìn)行驗(yàn)證。利用TGEVN蛋白鼠源單克隆抗體作為一抗，正常培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，接毒組出現(xiàn)明顯綠色熒光信號(hào)，而對(duì)照組未見熒光信號(hào)。

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本文編號(hào)：3384825