自2010年鴨坦布蘇病毒病在我國(guó)首次爆發(fā)以來(lái),該病給我國(guó)鴨養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋率驟降,并伴有高熱、食欲下降、運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致鴨死亡。第一株坦布蘇病毒分離株（MM1775株）,是從馬來(lái)西亞地區(qū)的蚊子體內(nèi)分離到的。在隨后幾十年陸續(xù)從蚊子體內(nèi)分離到很多株坦布蘇病毒,但卻很少有動(dòng)物感染該病毒的報(bào)道。到目前為止,早期坦布蘇病毒蚊體分離株在不同動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制能力、對(duì)動(dòng)物的致病性及在動(dòng)物間的傳播能力等生物學(xué)特性尚不可知。了解坦布蘇病毒早期分離株與我國(guó)現(xiàn)在流行的鴨坦布蘇病毒株的生物學(xué)特性的差異,對(duì)研究坦布蘇病毒的致病機(jī)制具有重要意義。為了比較MM1775和FX2010這兩株病毒基因組序列的差異,本研究測(cè)定了MM1775完整的基因組序列。通過(guò)5’和3’RACE技術(shù)擴(kuò)增得到MM1775基因組5’和3’末端的序列。利用RT-PCR擴(kuò)增得到10段兩兩重疊的涵蓋MM1775全基因組的目的片段,序列拼接后得到了MM1775全基因組序列。與FX2010的全基因組序列相比,編碼蛋白（C、pr M、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）依次有... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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’RACE（A）和3’RACE（B）電泳結(jié)果

圖 2.1 5’RACE（A）和 3’ RACE（B）電泳結(jié)果Fig. 2.1 ResμLts of 5’RACE（A） and 3’RACE（B）2.3.2 MM1775 基因組分片段擴(kuò)增結(jié)果在得到 MM1775 基因組 5’末端和 3’末端序列后，以設(shè)計(jì)的 7 個(gè)特異性反轉(zhuǎn)錄引物混合后作為特異性反轉(zhuǎn)錄引物，以病毒 RNA 為模板，經(jīng) SuperScriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以此 cDNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增、凝膠電泳（圖 2.2）、割膠回收等步驟，得到 10 段覆蓋全基因組的序列，經(jīng)拼接后得到 MM1775 全基因組序列。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 坦布蘇病毒 MM1775 株全基因組序列測(cè)定2.3.3 MM1775 和 FX2010 基因組序列比較利用 5’和 3’RACE 技術(shù)得到 MM1775 基因組 5’和 3’末端序列，隨后參考 GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的 MM1775 開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì) 10 對(duì) PCR 引物，擴(kuò)增得到 10 段特異性片段，相鄰兩個(gè)片段之間有一部分重疊序列，通過(guò)對(duì) 10 段 PCR 產(chǎn)物的純化、測(cè)序，并通過(guò) DNAstar 軟件中的 SegMan程序拼接得到 MM1775 的全基因序列。此序列的開(kāi)放閱讀框與 GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的 MM1775株開(kāi)放閱讀框有五個(gè)核苷酸不同，分別為 521(C/T)，1398(C/A)，1948(C/T)，5890(C/T) 和 7499(G/A)（核苷酸在基因組中的位置（本研究所用 MM1775 的核苷酸/已發(fā)表的 MM1775 核苷酸））。MM1775 全基因組共包含 11001bp 核苷酸，5’非翻譯區(qū)由 94 個(gè)核苷酸組成，3’非翻譯區(qū)由 629 個(gè)核苷酸組成，其中含有一個(gè)大小為 10278bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼產(chǎn)生大小為 3425 個(gè)氨基酸的多聚蛋白，同黃病毒屬的其他病毒一樣，該多聚蛋白在相關(guān)蛋白酶的作用下裂解為 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C，prM，E)和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B 和 NS5)。與 FX2010 的蛋白質(zhì)氨基酸殘基相比，不同點(diǎn)分別有：5/12(4.2%)，4/167(2.4%)，16/501(3.2%)，21/352(6.0%)，16/227(7.5%)，4/131(3.1%)，8/619(1.3%)，4/126(3.2%)，5/254(2.0%) 和 18/905(2.0%)（表 2.4）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鴨坦布蘇病毒TaqMan熒光定量PCR方法的優(yōu)化[J]. 彭珊,閆麗萍,李國(guó)新,李雪松,滕巧泱,肖亞莉,何文興,李澤君.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2013(04)
[2]密碼子優(yōu)化對(duì)鴨坦布蘇病毒E基因DNA疫苗免疫應(yīng)答的增強(qiáng)作用[J]. 徐大偉,李國(guó)新,李雪松,李云章,李澤君.  中國(guó)獸醫(yī)科學(xué). 2012(05)
[3]鴨坦布蘇病毒E基因DNA疫苗構(gòu)建及免疫原性的初步研究[J]. 徐大偉,李國(guó)新,李雪松,姬希文,李云章,李澤君.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(04)
[4]鴨坦布蘇病毒E蛋白的原核表達(dá)[J]. 姬希文,李雪松,邊延峰,李國(guó)新,顏丕熙,張七斤,李澤君.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2012(02)
[5]鴨坦布蘇病毒E蛋白中和性單克隆杭體的制備[J]. 姬希文,李雪松,李國(guó)新,肖亞莉,顏丕熙,徐大偉,范釗,張七斤,李澤君.  中國(guó)家禽. 2012(04)
[6]鴨坦布蘇病毒病病原的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 李澤君.  中國(guó)家禽. 2011(17)
[7]鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA檢測(cè)方法的建立[J]. 姬希文,閆麗萍,顏丕熙,李國(guó)新,張七斤,李澤君.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2011(08)
[8]應(yīng)用套式RT-PCR快速檢測(cè)鴨坦布蘇病毒[J]. 顏丕熙,李國(guó)新,吳曉剛,閆麗萍,滕巧泱,李澤君.  中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào). 2011(03)
[9]黃病毒的感染性克隆和嵌合突變體[J]. 范寶昌.  國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè). 2003(01)

碩士論文
[1]鴨坦布蘇病毒E蛋白抗原性分析[D]. 余磊.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[2]鴨坦布蘇病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D]. 石迎.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]鴨坦布蘇病毒弱毒株反向遺傳操作系統(tǒng)的建立[D]. 吳曉剛.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[4]鴨坦布蘇病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上的傳代致弱研究[D]. 肖亞莉.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2013



本文編號(hào)：3352740