本文關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒感染PK-15細(xì)胞前后microRNAs表達(dá)譜的研究及部分免疫功能的鑒定，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬細(xì)小病毒(PPV)是引起母豬繁殖障礙性疾病的重要病原之一。此外,PPV還能引起仔豬腹瀉、皮炎以及呼吸系統(tǒng)疾病,在豬非化膿性心肌炎、豬消瘦綜合癥和仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合癥等疾病中也發(fā)揮著重要的作用。全球普遍存在著豬細(xì)小病毒病,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展,對(duì)其造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。MicroRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為19-24nt的單鏈RNA分子,其通過與靶基因mRNA 3'UTR相互作用,在病毒的侵染、細(xì)胞的增殖分化及凋亡、腫瘤的發(fā)生、體內(nèi)平衡等許多生物學(xué)過程中起著重要的調(diào)控作用。目前,關(guān)于細(xì)胞miRNAs調(diào)節(jié)病毒感染的研究已有報(bào)道,其中包括乙型腦炎病毒,豬繁殖與呼吸綜合癥病毒,丙型肝炎病毒,A型流感病毒,豬瘟病毒等,但對(duì)于PPV感染PK-15細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞miRNAs表達(dá)卻未見報(bào)道。為了探究細(xì)胞miRNAs在PPV感染中的作用,本試驗(yàn)通過測定PPV的TCID50,在剛貼壁的PK-15細(xì)胞中按照1個(gè)MOI接種PPV,并于感染24h后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行總RNA的抽提,通過Solexa高通量測序方法篩選出符合要求的miRNAs,并對(duì)PPV感染前后細(xì)胞miRNAs的表達(dá)量進(jìn)行測定。同時(shí)根據(jù)PPV NS1的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)熒光定量檢測引物,建立了PPV熒光定量PCR方法。通過軟件預(yù)測能靶向PPV基因組的miRNAs,并將其與免疫有關(guān)的miRNAs共同轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,運(yùn)用建立的熒光定量方法對(duì)其功能進(jìn)行了驗(yàn)證。通過Solexa高通量測序結(jié)果表明,共有476條miRNAs在PPV感染前后表達(dá)量有所改變,其中240條miRNAs是對(duì)照組數(shù)據(jù)庫所特有的,13條miRNAs是試驗(yàn)組數(shù)據(jù)庫所特有的。對(duì)建立的細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),共有182條miRNAs差異表達(dá),其中60條miRNAs屬于上調(diào)表達(dá),122條miRNAs屬于下調(diào)表達(dá)。miR-21是表達(dá)量最大的,而miR-10b是差異最大的。對(duì)差異表達(dá)的miRNAs的靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn),C-JUN、MyD88、TLR7等與免疫有關(guān)的基因被預(yù)測出來,這結(jié)果表明這些差異表達(dá)的miRNAs可能參與PPV感染過程。通過實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證了隨機(jī)挑選的10個(gè)差異表達(dá)的miRNAs,其結(jié)果全部與Solexa高通量測序結(jié)果致。所建立的熒光定量PCR最佳退火溫度為59℃,其在1.59×109-1.59×104copies/μL可得到較為理性的標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)R2為0.997,擴(kuò)增效率為97.2%,且其特異性和重復(fù)性都很好,能被運(yùn)用于miRNAs 功能試驗(yàn)的驗(yàn)證。PPV基因組靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果顯示,miR-34a能靶向PPV NS1的編碼區(qū),且該編碼區(qū)在PPV病毒中屬于高度保守序列。熒光定量PCR結(jié)果顯示,miR-34a能抑制PPV的復(fù)制,而其他的miRNAs則不能,但其具體的抑制機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了豬PK-15細(xì)胞的小RNA數(shù)據(jù)庫,并建立了PPV感染前后細(xì)胞miRNAs的表達(dá)譜,對(duì)其差異表達(dá)的miRNAs及其靶標(biāo)分析,有助于在miRNAs的層面上了解PPV感染機(jī)制以及宿主抗病毒免疫的分子機(jī)制。本試驗(yàn)同時(shí)也證實(shí)了miR-34a能抑制豬細(xì)小病毒的復(fù)制,這為PPV的防治提供了一條新思路。
【關(guān)鍵詞】：豬細(xì)小病毒 miRNAs PK-15細(xì)胞 NS1基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略詞8-12
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述及研究的目的與意義12-26
• 一 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1 細(xì)小病毒概述12
• 2 豬細(xì)小病毒概述12-18
• 2.1 豬細(xì)小病毒的病原學(xué)12-14
• 2.2 豬細(xì)小病毒的分子生物學(xué)特性14-16
• 2.2.1 豬細(xì)小病毒的基因組結(jié)構(gòu)14-15
• 2.2.2 豬細(xì)小病毒的DNA復(fù)制15
• 2.2.3 豬細(xì)小病毒編碼的蛋白及功能15-16
• 2.2.4 豬細(xì)小病毒的致病機(jī)制16
• 2.3 豬細(xì)小病毒的流行病學(xué)16-17
• 2.4 豬細(xì)小病毒的防制17-18
• 3 MicroRNAs的概述18-23
• 3.1 MicroRNAs的發(fā)現(xiàn)18
• 3.2 MicroRNAs的合成18-19
• 3.3 MicroRNAs的作用機(jī)制19-20
• 3.4 MicroRNAs的研究方法20-21
• 3.5 microRNAs基因預(yù)測和靶基因預(yù)測21
• 3.6 MicroRNAs與免疫21-23
• 4 microRNAs在宿主-病毒中的作用23-25
• 二 研究的目的與意義25-26
• 第二部分 試驗(yàn)部分26-54
• 第一章 PK-15細(xì)胞microRNAs數(shù)據(jù)庫的建立及與PPV有關(guān)的microRNAs的分析26-40
• 1 材料26-27
• 1.1 細(xì)胞及毒株26
• 1.2 主要試劑及儀器26
• 1.3 主要試劑的配置26-27
• 2 方法27-31
• 2.1 PK-15細(xì)胞的傳代培養(yǎng)27
• 2.2 TCID_(50)的測定27
• 2.3 PPV感染27
• 2.4 細(xì)胞總RNA的提取27-28
• 2.5 PK-15細(xì)胞microRNAs數(shù)據(jù)庫的建立28-29
• 2.5.1 細(xì)胞樣品RNA的提取及鑒定28
• 2.5.2 數(shù)據(jù)庫的建立及高通量測序28
• 2.5.3 miRNAs的篩選28-29
• 2.6 miRNAs熒光定量的驗(yàn)證29-31
• 3 結(jié)果31-37
• 3.1 TCID_(50)檢測結(jié)果31-32
• 3.2 PPV感染PK-15細(xì)胞32
• 3.3 RNA樣品的檢測32-33
• 3.4 高通量測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)33-35
• 3.5 差異表達(dá)的miRNAs及其靶基因的預(yù)測35-36
• 3.6 熒光定量驗(yàn)證結(jié)果36-37
• 4 討論37-39
• 5 小結(jié)39-40
• 第二章 PPV熒光定量方法的建立及部分miRNAs功能驗(yàn)證40-54
• 1 材料40-41
• 1.1 細(xì)胞、菌株及毒株40
• 1.2 生物試劑及器材40
• 1.3 主要試劑的配制40-41
• 2 方法41-45
• 2.1 PPV引物合成41
• 2.2 PPV DNA抽提41-42
• 2.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建42-43
• 2.3.1 熒光定量PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物的回收42
• 2.3.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備42-43
• 2.3.3 連接與轉(zhuǎn)化43
• 2.3.4 質(zhì)粒的抽提與鑒定43
• 2.4 熒光定量PCR43-44
• 2.4.1 PPV熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制43-44
• 2.4.2 重復(fù)性和特異性44
• 2.5 miRNAs靶標(biāo)的預(yù)測與功能的驗(yàn)證44-45
• 2.5.1 靶標(biāo)的預(yù)測及miRNAs篩選44
• 2.5.2 轉(zhuǎn)染44-45
• 2.5.3 熒光定量檢測45
• 3 結(jié)果45-51
• 3.1 PPV熒光定量引物檢測45-46
• 3.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及測序46-47
• 3.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制47
• 3.4 熒光定量PCR重復(fù)性和特異性47-48
• 3.5 靶標(biāo)預(yù)測與功能驗(yàn)證48-51
• 4 討論51-52
• 5 小結(jié)52-54
• 參考文獻(xiàn)54-66
• 致謝66-67
• 附表67-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄80

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