本文關(guān)鍵詞：RRSV在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒屬(Oryzavirus)的成員。RRSV基因組包含10條dsRNA,編碼11種蛋白質(zhì),其中包括8種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白。該病毒引起的水稻齒葉矮縮病在我國(guó)南方發(fā)病嚴(yán)重,對(duì)當(dāng)?shù)氐乃旧a(chǎn)造成嚴(yán)重影響,成為我國(guó)水稻生產(chǎn)上的重要病害。本文通過建立水稻原生質(zhì)體培養(yǎng)體系,制備RRSV抗血清,通過免疫熒光、熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)技術(shù)研究RRSV編碼3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(Pns6、Pns7和Pns10)及主要外殼蛋白P8的基因在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制與表達(dá)情況。結(jié)果表明：(1)通過原核表達(dá)制備的抗血清經(jīng)Western blot和間接ELISA的方法檢測(cè)證明其可用于病毒檢測(cè)的應(yīng)用；(2)通過免疫熒光標(biāo)記RRSV Pns10,激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)病毒粒子可以成功侵染水稻原生質(zhì)體,并可形成類似于病毒原質(zhì)的組分,該組分隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸發(fā)生聚集；(3)利用熒光定量PCR技術(shù),通過對(duì)病毒侵染水稻原生質(zhì)體不同時(shí)間段進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn),在接種病毒后的60 h內(nèi),RRSV各檢測(cè)基因在8 h時(shí)開始積累,后均呈上升趨勢(shì),表達(dá)非結(jié)構(gòu)蛋白的S6、S7、S1O在24 h左右mRNA表達(dá)量達(dá)到最大值,表達(dá)CP的S8基因在32 h左右增值達(dá)到最大值,此后表達(dá)量均開始下降,但仍保持在較高水平,該結(jié)果表明在病毒侵染水稻原生質(zhì)體細(xì)胞24-32 h時(shí)達(dá)到復(fù)制轉(zhuǎn)錄高峰期；(4)以制備的RRSV抗血清為探針,通過Western blot檢測(cè)到病毒侵染原生質(zhì)體后,非結(jié)構(gòu)蛋白Pns7和Pns10在12 h開始表達(dá),在32 h左右達(dá)到最大值,結(jié)構(gòu)蛋白P8在24 h開始表達(dá),在48 h左右達(dá)到最大值,表明非結(jié)構(gòu)蛋白先于外殼蛋白表達(dá),RRSV粒體在侵染水稻原生質(zhì)體24 h開始增殖,48 h左右達(dá)到最大值；(5)通過煙草的瞬時(shí)表達(dá)體系表達(dá)RRSV4個(gè)目的基因和YFP的融合蛋白,在激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光在煙草細(xì)胞中的分布,發(fā)現(xiàn)RRSVPns6在細(xì)胞膜處,可以形成小顆粒狀聚集體,Pns7可能定位在細(xì)胞質(zhì),P8作為主要外殼蛋白定位在細(xì)胞核,Pns10可在細(xì)胞內(nèi)形成大量的顆粒狀聚集體,形成類似于病毒原質(zhì)的顆粒狀內(nèi)含體。
【關(guān)鍵詞】：水稻齒葉矮縮病毒 水稻原生質(zhì)體 抗體制備 基因復(fù)制與表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S511
【目錄】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 第一章 前言11-17
• 1.1 水稻齒葉矮縮病毒的研究概況11-14
• 1.1.1 水稻齒葉矮縮病的發(fā)生及危害11
• 1.1.2 水稻齒葉矮縮病的傳播及癥狀11-12
• 1.1.3 水稻齒葉矮縮病毒的粒子特性12
• 1.1.4 RRSV的基因組結(jié)構(gòu)12
• 1.1.5 RRSV編碼蛋白的功能12-14
• 1.2 植物病毒侵染原生質(zhì)體的研究概況14-16
• 1.2.1 原生質(zhì)體在植物病毒研究中的作用14
• 1.2.2 植物病毒復(fù)制組裝的研究14-15
• 1.2.3 植物病毒在原生質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制和表達(dá)研究15-16
• 1.3 本研究的目的和意義16-17
• 第二章 RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白及外殼蛋白的原核表達(dá)及其抗血清的制備17-30
• 2.1 材料17
• 2.1.1 供試材料17
• 2.1.2 酶和試劑17
• 2.1.3 菌種、載體17
• 2.2 方法17-24
• 2.2.1 引物設(shè)計(jì)17-18
• 2.2.2 感染RRSV的水稻總RNA的提取18-19
• 2.2.3 目的基因的擴(kuò)增19-20
• 2.2.4 RRSV目的基因Gateway入門載體的構(gòu)建20-21
• 2.2.5 RRSV目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建21-22
• 2.2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測(cè)22
• 2.2.7 抗血清的制備22-23
• 2.2.8 Western blot和間接ELISA檢測(cè)23-24
• 2.2.9 提純抗體免疫球蛋白G24
• 2.2.10 熒光抗體的交聯(lián)24
• 2.3 結(jié)果24-29
• 2.3.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建24-26
• 2.3.2 目的蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)26
• 2.3.3 多克隆抗體特異性檢測(cè)26-27
• 2.3.4 多克隆抗體效價(jià)檢測(cè)27-29
• 2.4 討論29-30
• 第三章 RRSV在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)動(dòng)態(tài)30-45
• 3.1 材料30
• 3.1.1 供試材料30
• 3.1.2 酶和化學(xué)試劑30
• 3.2 方法30-35
• 3.2.1 水稻日本晴品種無菌苗培育30
• 3.2.2 日本晴水稻原生質(zhì)體的制備30-31
• 3.2.3 原生質(zhì)體活性的檢測(cè)31-32
• 3.2.4 RRSV粗提液的提取32
• 3.2.5 RRSV侵染水稻原生質(zhì)體32
• 3.2.6 不同時(shí)間樣品RNA的提取32-33
• 3.2.7 cDNA的合成33-34
• 3.2.8 RRSV目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立34
• 3.2.9 Real Time PCR檢測(cè)不同時(shí)間樣品中目的基因的表達(dá)量34
• 3.2.10 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間樣品中目的蛋白的表達(dá)34
• 3.2.11 免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)蛋白的表達(dá)34-35
• 3.3 結(jié)果35-43
• 3.3.1 水稻原生質(zhì)體的制備及活性檢測(cè)35
• 3.3.2 原生質(zhì)體樣本總RNA的質(zhì)量檢測(cè)35-36
• 3.3.3 實(shí)時(shí)定量引物擴(kuò)增效率檢測(cè)36-40
• 3.3.4 熒光定量PCR檢測(cè)不同時(shí)間樣品中目的基因的表達(dá)量40-42
• 3.3.5 Western blot檢測(cè)樣品中目的蛋白的表達(dá)42
• 3.3.6 免疫熒光標(biāo)記RRSV在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的表達(dá)42-43
• 3.4 討論43-45
• 第四章 RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白和外殼蛋白的亞細(xì)胞定位45-52
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 供試材料45
• 4.1.2 酶和化學(xué)試劑45
• 4.1.3 菌種、載體45
• 4.1.4 PCR引物45-46
• 4.2 方法46-47
• 4.2.1 RRSV基因組擴(kuò)增46
• 4.2.2 RRSV入門載體的構(gòu)建46
• 4.2.3 入門載體線性化46
• 4.2.4 RRSV植物表達(dá)載體的構(gòu)建46-47
• 4.2.5 RRSV植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌47
• 4.2.6 誘導(dǎo)農(nóng)桿菌注射本氏煙47
• 4.3 結(jié)果47-50
• 4.3.1 RRSV基因片段的擴(kuò)增47-48
• 4.3.2 RRSV與pDONOR221入門載體的構(gòu)建48-49
• 4.3.3 RRSV與植物表達(dá)載體pEarleyGate101的構(gòu)建49
• 4.3.4 病毒基因在本氏煙細(xì)胞中的定位49-50
• 4.4 討論50-52
• 研究總結(jié)及展望52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 附錄57-61
• 致謝61

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1 陳曉敏;RRSV在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制與表達(dá)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：RRSV在水稻原生質(zhì)體內(nèi)的復(fù)制與表達(dá)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：322430