本文關鍵詞：豬轉鐵蛋白受體與PPV-VP2相互作用的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：轉鐵蛋白受體(TfR)是位于細胞膜上的Ⅱ型跨膜糖蛋白,能夠介導含鐵的轉鐵蛋白從胞外轉移至胞內。豬細小病毒(PPV)的基因組由長度約為5000nt的單股負鏈DNA構成,可編碼三種結構蛋白(VP1,VP2及VP2)及三種非結構蛋白(NS1,NS2及NS3)。VP2占據(jù)病毒衣殼的絕大部分,約80%,并且能夠自我組裝成類病毒粒子。病毒的感染和復制起始于其與細胞表面受體的結合,這也是影響病毒宿主特異性、致病性及組織嗜性的關鍵因素之一。已有研究證實,與PPV同屬的犬細小病毒(CPV)和貓瘟熱病毒(FPV)的細胞表面受體是TfR,通過病毒的VP2蛋白與其結合,進而感染細胞。盡管PPV與CPV衣殼蛋白氨基酸的組成不盡相同,但其同源性較高,可達50~60%�；诖送葱钥赏茰yPPV也能夠通過VP2與細胞表面的TfR結合,進而感染細胞。然而,很少有明確的證據(jù)表明,TfR是PPV的細胞表面受體,甚至有些證據(jù)表明,TfR不是PPV的細胞表面受體。為了明確TfR是否為PPV的受體,本實驗進行前期的準備以及一些初步檢測,主要包括定量PCR檢測方法的建立、蛋白的表達及相互作用的初步鑒定、穩(wěn)定表達豬TfR的HEK293細胞系的建立等。本研究針對PPV VP2、Tf R和管家基因β-actin的序列設計了特異性的引物,分別建立了SYBRGreen熒光定量PCR檢測方法。結果表明:所構建的熒光定量PCR檢測方法均無非特異性擴增,檢測下線均在10拷貝以內,變異系數(shù)均小于3%。本研究建立的SYBR Green熒光定量PCR方法重復性好、敏感性高、特異性強,適用于對PPV及TfR的定量檢測。利用所建立的SYBR Green熒光定量PCR檢測方法對PPV感染ST前后PPV的增殖情況及TfR的轉錄時象進行了對應檢測分析,結果表明:PPV在感染ST細胞前后消耗了一定的豬TfR來進行自身的增殖,TfR消耗特征符合作為PPV的細胞表面受體的特征。免疫共沉淀是一種研究蛋白之間相互作用的方法,本研究分別構建了VP2和TfR的重組表達質粒,利用激光共聚焦試驗證實了VP2蛋白和TfR蛋白可在細胞膜上共定位,進一步才用免疫共沉淀試驗驗證二者是否具有相互作用,結果表明:二者不存在直接相互作用或不具有相互作用。為進一步探索二者的相互作用,本研究構建了穩(wěn)定表達豬TfR的HEK293細胞系并對其進行了鑒定,結果表明,所構建的細胞系TfR基因的整合效率達90%以上,蛋白的表達效率也較高。而PPV對該細胞的感染試驗表明PPV對該細胞不具有感染能力。以上試驗結果表明TfR不是PPV的細胞表面受體,PPV的細胞表面受體還有待進一步研究。
【關鍵詞】：豬細小病毒 豬轉鐵蛋白受體 熒光定量PCR 免疫共沉淀 穩(wěn)定細胞系
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要7-8
• Abstract8-15
• 英文縮略表15-16
• 第一章 引言16-23
• 1.1 豬細小病毒的研究進展16-19
• 1.1.1 PPV的病原學16-17
• 1.1.2 基因組結構17-18
• 1.1.3 基因組的復制與轉錄18
• 1.1.4 PPV基因組編碼蛋白和功能18-19
• 1.2 轉鐵蛋白受體的研究進展19-21
• 1.2.1 TfR的結構19-20
• 1.2.2 TfR的功能20-21
• 1.3 病毒的細胞受體21-22
• 1.3.1 細胞表面病毒受體的研究方法21
• 1.3.2 TfR作為病毒細胞受體的研究進展21-22
• 1.4 本研究的目的和意義22-23
• 第二章 熒光定量PCR方法的建立及應用23-34
• 2.1 材料23
• 2.1.1 細胞、毒株及主要試劑23
• 2.1.2 主要儀器設備23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 引物設計23-24
• 2.2.2 PPV在ST細胞上的增殖實驗24
• 2.2.3 病毒DNA的提取24
• 2.2.4 病毒及細胞總RNA的提取及反轉錄24-25
• 2.2.5 熒光定量PCR標準曲線的建立25
• 2.2.6 敏感性分析25-26
• 2.2.7 特異性分析26
• 2.2.8 重復性分析26
• 2.2.9 PPV增殖曲線的建立26
• 2.2.10 熒光定量PCR方法檢測PPV感染ST細胞后PPV增殖情況及TfRmRNA轉錄水平的變化26
• 2.2.11 統(tǒng)計分析26
• 2.3 結果26-32
• 2.3.1 熒光定量PCR的引物特異性鑒定26-27
• 2.3.2 熒光定量標準曲線的建立27-30
• 2.3.3 敏感性分析結果30
• 2.3.4 特異性分析結果30-31
• 2.3.5 重復性分析結果31
• 2.3.6 PPV的增殖曲線31-32
• 2.3.7 PPV感染后的TfR的轉錄實相32
• 2.4 討論32-34
• 第三章 TfR和VP2的真核表達34-45
• 3.1 材料34-35
• 3.1.1 細胞、質粒及主要試劑34
• 3.1.2 主要儀器34-35
• 3.2 方法35-40
• 3.2.1 引物的設計35
• 3.2.2 真核表達質粒的構建35-38
• 3.2.3 HEK293T細胞的復蘇38
• 3.2.4 HEK293T細胞的培養(yǎng)38
• 3.2.5 細胞的轉染38
• 3.2.6 Western blot檢測38-39
• 3.2.7 激光共聚焦實驗39
• 3.2.8 免疫共沉淀實驗39-40
• 3.3 結果40-44
• 3.3.1 目的基因的擴增結果40
• 3.3.2 重組質粒的鑒定40-41
• 3.3.3 Western blot檢測重組質粒的表達41-42
• 3.3.4 用激光共聚焦實驗檢測VP2蛋白和TfR蛋白的共定位42
• 3.3.5 用免疫共沉淀實驗檢測VP2蛋白和TfR蛋白的相互作用42-44
• 3.4 討論44-45
• 第四章 穩(wěn)定表達豬TfR的HEK293細胞系的建立45-57
• 4.1 材料45-46
• 4.1.1 細胞、質粒和菌種45
• 4.1.2 主要試劑45
• 4.1.3 主要實驗儀器45-46
• 4.2 方法46-51
• 4.2.1 引物的設計46
• 4.2.2 pLVX-TfR-His重組質粒的構建與鑒定46-48
• 4.2.3 TfR在HEK293T細胞中的瞬時表達及western blot鑒定48
• 4.2.4 重組慢病毒包裝及病毒滴度的測定48-49
• 4.2.5 慢病毒轉導和細胞篩選49-50
• 4.2.6 篩選細胞的鑒定50
• 4.2.7 病毒感染實驗50-51
• 4.3 結果51-56
• 4.3.1 重組慢病毒載體的構建51
• 4.3.2 HEK293T細胞的綠色熒光檢測及western blot鑒定51-52
• 4.3.3 重組慢病毒包裝及病毒滴度的測定52
• 4.3.4 HEK293-TfR細胞及HEK293-ZsGreen細胞的篩選52-53
• 4.3.5 篩選細胞的鑒定53-54
• 4.3.6 病毒感染試驗54-56
• 4.4 討論56-57
• 第五章 全文結論57-58
• 參考文獻58-65
• 致謝65-66
• 作者簡歷66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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  本文關鍵詞：豬轉鐵蛋白受體與PPV-VP2相互作用的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：319921