采用RNAi技術(shù)進(jìn)行害蟲防治是一種全新的害蟲防治策略。V-ATP酶是昆蟲體內(nèi)與能量轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的H+質(zhì)子泵,是維持昆蟲生命體征的關(guān)鍵蛋白。本研究中首先對小地老虎V-ATP酶的A、B亞基進(jìn)行了全長c DNA克隆,然后以B亞基為靶基因,構(gòu)建了沉默B亞基基因的桿狀病毒載體,具體結(jié)果如下:（1）采用RACE技術(shù)克隆了小地老虎V-ATP酶A亞基和B亞基的基因全長,并對基因進(jìn)行了分析。A亞基基因全長2693bp,其中CDS區(qū)1851bp,翻譯616個氨基酸,蛋白的分子量為68.06KD;B亞基2583bp,其中CDS區(qū)1491bp,編碼496個氨基酸,蛋白的分子量為50.01KD。目前,這兩個基因已提交至基因庫中,并獲得基因登錄號（A亞基:KM434187;B亞基:KM434188）。（2）根據(jù)V-ATP酶B亞基基因序列,設(shè)計并合成了3條si RNA,注射到小地老虎3齡幼蟲后進(jìn)行q-PCR檢測。選取干擾效果最好的si1（干擾效率44.90%）進(jìn)行后續(xù)的載體構(gòu)建。（3）轉(zhuǎn)染sf21細(xì)胞系,將小鼠U6啟動子和B亞基sh RNA構(gòu)建到昆蟲桿狀病毒載體p Bac PAK9中,篩選出對小地老虎V-ATP酶具有特... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 前言
    1.2 RNAi
        1.2.1 RNA干擾的原理
        1.2.2 RNA干擾的特點(diǎn)
    1.3 RNA干擾介導(dǎo)的方法
        1.3.1 注射法
        1.3.2 飼喂法
        1.3.3 浸液法
        1.3.4 轉(zhuǎn)基因植物
    1.4 RNA干擾的應(yīng)用
        1.4.1 在基因治療中的應(yīng)用
        1.4.2 在基因功能研究中的應(yīng)用
        1.4.3 在植物改良中的應(yīng)用
    1.5 在昆蟲防治中的應(yīng)用
    1.6 RNAi應(yīng)用于昆蟲防治的問題和展望
    1.7 小地老虎
    1.8 V-ATP酶
        1.8.1 V-ATP酶的結(jié)構(gòu)和功能
        1.8.2 昆蟲V-ATP酶的研究進(jìn)展
    1.9 研究的目的和意義
第二章 小地老虎V-ATP酶A亞基和B亞基基因全長的克隆
    2.1 前言
    2.2 材料與試劑
        2.2.1 主要試劑
        2.2.2 主要儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 小地老虎總RNA的提取
        2.3.2 特異引物設(shè)計
        2.3.3 保守序列擴(kuò)增
        2.3.4 合成 3′和 5′-RACE-Ready cDNA
        2.3.5 cDNA3′末端和 5′末端的克隆
        2.3.6 連接轉(zhuǎn)化
        2.3.7 測序拼接及CDS區(qū)的獲得
        2.3.8 基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化性分析
    2.4 結(jié)果分析
        2.4.1 小地老虎總RNA的提取
        2.4.2 保守序列的擴(kuò)增
        2.4.3 A亞基 3'和 5'末端的克隆
        2.4.4 B亞基 3'和 5'末端的克隆
        2.4.5 A亞基基因CDS區(qū)的克隆及序列分析
        2.4.6 B亞基基因CDS區(qū)的克隆及序列分析
    2.5 小結(jié)與討論
第三章 SiRNA的設(shè)計與篩選
    3.1 前言
    3.2 材料與試劑
        3.2.1 主要試劑與材料
        3.2.2 主要儀器
    3.3 實驗方法：
        3.3.1 SiRNA的設(shè)計合成及注射
        3.3.2 顯微注射
        3.3.3 定量引物設(shè)計
        3.3.4 干擾結(jié)果檢測
        3.3.5 定量結(jié)果分析
    3.4 結(jié)果分析
        3.4.1 定量引物標(biāo)準(zhǔn)曲線
        3.4.2 定量結(jié)果分析
    3.5 小結(jié)與討論
第四章 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
    4.1 前言
    4.2 材料與試劑
        4.2.1 主要材料
        4.2.2 主要儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 穿梭載體的構(gòu)建
        4.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)
        4.3.3 轉(zhuǎn)染并重組病毒表達(dá)載體
        4.3.4 噬斑實驗
        4.3.5 桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性
        4.3.6 桿狀病毒對小地老虎的干擾效果檢測
    4.4 結(jié)果分析
        4.4.1 穿梭載體的構(gòu)建
        4.4.2 重組桿狀病毒
        4.4.3 桿狀病毒遺傳穩(wěn)定性
        4.4.4 對小地老虎的干擾效果檢測
    4.5 小結(jié)與討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]家蠶空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表達(dá)特征[J]. 王鑫,李懿,陳全梅,衣啟營,謝康,吳用,趙萍.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(08)
[2]桔小實蠅V-ATPaseG亞基基因的克隆及組織表達(dá)特異性分析[J]. 胡黎明,申建梅,賓淑英,林進(jìn)添.  昆蟲學(xué)報. 2011(12)
[3]昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的研究及其新進(jìn)展[J]. 孫陽,張淑穎.  江西農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2006(05)
[4]小地老虎的防治措施[J]. 張俊斌.  山西農(nóng)業(yè). 2005(03)
[5]小地老虎在灤南縣危害嚴(yán)重[J]. 王洪梅.  河北農(nóng)業(yè). 2002(03)
[6]蔬菜田小地老虎的發(fā)生特點(diǎn)及防治[J]. 姜海洲,李瑛,何永垠,丁志寬.  蔬菜. 2000(06)
[7]小地老虎幼蟲齡期外部形態(tài)的區(qū)別[J]. 陳家暢,李樹英.  植物保護(hù). 1964(03)



本文編號：3121481