發(fā)布時間：2021-02-21 02:41

　　病原微生物的侵染導致的植物病害對農作物的產量和質量造成了巨大損失,促使人們不斷探索植物抗病信號傳導路徑。有抗病能力的植物受到病原微生物侵染時,許多局部反應如乙烯的快速釋放、各種防御基因的激活以及超敏反應（Hypersensitive responses,HR）等發(fā)揮著直接或間接作用。在這些反應發(fā)生之后,會進一步誘導未受侵染的植物部位表現出對多種病原體的持久抗性,即系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic Acquired Resistance,SAR）。而植物內源激素水楊酸（Salicylic acid,SA）是介導系統(tǒng)獲得性抗性的重要信號。SABP3（Salicylic Acid Binding Protein 3）是一種SA結合蛋白,屬于葉綠體碳酸酐酶（CA）,同時具有SA結合活性和CA酶活性,對于在病原體感染期間誘導宿主抗性至關重要。在本研究中,通過酵母文庫篩選得到了與SABP3互作的蛋白——S-腺苷甲硫氨酸合成酶2（S-adenosylmethionine synthases 2,SAM2/MAT2）。它是一種甲硫氨酸腺苷轉移酶,其催化甲硫氨酸產生S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl... 

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

【文章頁數】：69 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

酵母雙雜交載體的構建和驗證

擬南芥SABP3互作蛋白的鑒定及其介導的抗病機理解析26圖1酵母雙雜交載體的構建和驗證Fig.1ConstructionofvectorpGADT7（A）片段的獲得。M，DL2000DNAMarker；1-4：由Col-0cDNA中擴增得到MAT2的cDNA片段。（A）Obtainingfragments.M,DL2000DNAMarker;1-4:ThefragmentofMAT2amplifiedfromCol-0cDNA.（B）pGADT7::MAT2的NdeI/EcoRI雙酶切驗證。M，DL5000DNAMarker；1-3：pGADT7::MAT2質粒。（B）VerificationofpGADT7::MAT2byNdeI/EcoRIdoubledigestion.M,DL5000DNAMarker;1-3pGADT7::MATvector.然后將構建好的AD載體和連接SABP3基因片段的BD載體通過酵母熱激轉化分別轉化到酵母菌中。經過兩缺培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp）的篩選后選取同時具有AD、BD載體的酵母單克隆菌落轉到四缺培養(yǎng)基（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）上繼續(xù)培養(yǎng)以檢測是否存在相互作用。觀察發(fā)現只有同時含有pGADT7::MAT2質粒和pGBKT7::SABP3質粒的酵母菌落能夠正常生長且變藍（圖2）。表明在酵母系統(tǒng)中SABP3能夠和MAT2發(fā)生互作，而不和其同源蛋白MAT1、MAT3和MAT4互作。圖2SABP3蛋白與MAT2互作Fig.2SABP3proteininteractionwithMAT2酵母雙雜交（Y2H）分析中SABP3能夠和MAT2互作�；プ黩炞C在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade上進行。InteractionbetweenSABP3andMAT2inyeasttwo-hybrid(Y2H)assays.TheinteractionwasvalidatedonSD/-Leu/-Trp/-His/-Ademedia.

山東農業(yè)大學碩士學位論文27在活體植物中，利用BIFC技術驗證SABP3和MAT2互作的真實性。首先構建MAT2與N端YFP蛋白的瞬時表達載體pSPYNE-MAT2，以及SABP3與C端GFP蛋白的載體pSPYCE-SABP3。將構建好的載體通過電激轉化至農桿菌GV3101中，配對后在煙草葉片上進行共表達。共聚焦顯微鏡下觀察的結果顯示，空pSPYNE載體與空pSPYCE載體共轉化到煙草中，未能檢測到綠色熒光蛋白（GFP）的熒光信號。而pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3在煙草中共表達后，在其下表皮細胞的細胞質中能夠檢測到清晰的GFP熒光信號（圖3），這表明在植物體內SABP3與MAT2發(fā)生相互作用。圖3BiFC證實SABP3和MAT2的相互作用Fig.3BiFCassayshowedtheinteractionbetweenSABP3andMAT2（A）pSPYNE::MAT2和pSPYCE::SABP3的質粒PCR檢測。M，DL2000DNAMarker。（B）雙分子熒光互補（BiFC）實驗表明，SABP3和MAT2在細胞質中共定位。侵染表達3天后，用共聚焦顯微鏡對GFP信號成像。這些實驗至少重復了3次，結果相似。圖片標尺=20μm。（A）PlasmidPCRdetectionofpSPYNE::MAT2andpSPYCE::SABP3.M，DL2000DNAMarker.（B）Bimolecularfluorescencecomplementation(BiFC)assaysshowco-localizationofSABP3andMAT2inthecytoplasm.ConfocalmicroscopywasusedtoimageGFPsignals3daysafterinfiltration.Theseexperimentswererepeatedatleastthreetimeswithsimilarresults.Imagescale=20μm.

【參考文獻】：
期刊論文
[1]乙烯介導的防衛(wèi)信號途徑研究進展[J]. 鄒驍剛.  安徽農業(yè)科學. 2012(11)
[2]農作物乙烯合成和信號轉導途徑及其對抗病反應的調控[J]. 翁宇,戴小楓.  分子植物育種. 2008(04)

博士論文
[1]銅離子激發(fā)擬南芥免疫機制的研究[D]. 張寶剛.山東農業(yè)大學 2018



本文編號：3043726