HAB-5菌株是本實驗室從棉花土壤根際中分離得到的一株短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）,具有廣譜的抑菌效果。hpalxoo和hpaXm基因分別來自水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）和棉花角斑病菌（X. citri subsp. Malvacearum nov.comb. nov. nom. nov.）,編碼抗病激活蛋白harpinX,本研究利用化學方法將hpalxoo和hpaXm基因分別轉(zhuǎn)化至野生型HAB-5菌株中,以期能實現(xiàn)harpin蛋白在短短芽孢桿菌內(nèi)的高效表達,構建更高效穩(wěn)定的生防菌株,為新型生物農(nóng)藥的開發(fā)和利用奠定基礎。具體研究結果如下：1.將hpalxoo及hpaXm基因轉(zhuǎn)化HAB-5菌株,48h后在Amp抗性平板上得到了陽性轉(zhuǎn)化子,其中,共獲得轉(zhuǎn)入hpalxoo的轉(zhuǎn)化子有581個,轉(zhuǎn)入hpaXm的轉(zhuǎn)化子有650個。經(jīng)PCR和PCR Southern Blot研究證實,目的基因hpaXm和hpalxoo已插入轉(zhuǎn)化子中。2.在LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)72h后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子菌株菌落形態(tài)均發(fā)生了一定程度上的改變。經(jīng)對峙培... 

【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
一、引言
    1. hrp基因及其編碼的harpin蛋白
        1.1 hrp基因和harpin蛋白
        1.2 Harpin蛋白在植物上的功能
            1.2.1 誘導植物抗病
            1.2.2 促進植物生長發(fā)育和誘導植物抗蟲
            1.2.3 誘導植株耐旱
        1.3 Harpin激發(fā)防衛(wèi)反應
            1.3.1 過敏性反應（HR）
            1.3.2 氧爆發(fā)
            1.3.3 其他防衛(wèi)反應
        1.4 Harpin蛋白的表達系統(tǒng)
    2. 短短芽孢桿菌及其遺傳改良
        2.1 短短芽孢桿菌的生物特性
        2.2 短短芽孢桿菌的抑菌作用及其機制
            2.2.1 對病原菌的抑制作用
            2.2.2 短短芽孢桿菌的抑菌作用機制
        2.3 短短芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)
            2.3.1 短桿菌肽
            2.3.2 短桿菌酪肽
            2.3.3 其它抗菌物質(zhì)
        2.4 短短芽孢桿菌在國內(nèi)外的研究及其應用
            2.4.1 對植物的促生作用
            2.4.2 保鮮作用
            2.4.3 微生物降解
            2.4.4 其他方面
            2.4.5 短短芽孢桿菌的防病作用
        2.5 短短芽孢桿菌的遺傳改良
            2.5.1 短短芽孢桿菌表達系統(tǒng)
            2.5.2 芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化方法
    3. 生長素的極性運輸抑制劑（TIBA）
    4. 本研究意義
二、材料與方法
    1. 材料
        1.1 供試菌株
        1.2 供試菌株材料
        1.3 培養(yǎng)基
        1.4 主要試劑
    2. 方法
        2.1 質(zhì)粒提取
Xoo及hpa_Xm基因轉(zhuǎn)入HAB-5菌株">        2.2 hpa1_Xoo及hpa_Xm基因轉(zhuǎn)入HAB-5菌株
        2.3 引物設計與合成
        2.4 目的基因的PCR驗證
        2.5 切膠回收
        2.6 克隆轉(zhuǎn)化及測序
        2.7 HAB-5及其轉(zhuǎn)化子菌株菌落形態(tài)和對C7-2菌株的平板拮抗作用測定
            2.7.1 菌株菌落形態(tài)觀察
            2.7.2 對芒果炭疽菌C7-2菌株的平板拮抗作用
        2.8 粗蛋白的提取方法
        2.9 SDS-PAGE電泳
        2.10 煙草過敏性反應（HR）
        2.11 轉(zhuǎn)化子粗蛋白特性的研究
            2.11.1 轉(zhuǎn)化子粗蛋白熱穩(wěn)定性測定
            2.11.2 轉(zhuǎn)化子粗蛋白耐酸堿性測定
            2.11.3 轉(zhuǎn)化子粗蛋白對胰蛋白酶和蛋白酶K穩(wěn)定性的測定
            2.11.4 轉(zhuǎn)化子粗蛋白紫外線敏感性測定
        2.12 菌懸液和發(fā)酵液的配置
        2.13 短短芽孢桿菌HAB-5及其轉(zhuǎn)化子菌株對番茄種子的促生作用測定
            2.13.1 對番茄種子的促生作用
            2.13.2 TIBA對抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用
        2.14 對芒果炭疽離體葉片的拮抗效果
        2.15 PCR Southern Blot
            2.15.1 目的基因的PCR
            2.15.2 探針制備方法
            2.15.3 試劑配制
            2.15.4 洗膠和轉(zhuǎn)膜
            2.15.5 預雜交和雜交
            2.15.6 洗膜和顯色
三、結果與分析
    1. 轉(zhuǎn)化子菌株的篩選及PCR驗證
    2. PCR Southern Blot驗證
        2.1 目的基因的PCR擴增
        2.2 探針的制備和標記
        2.3 PCR Southern Blot
    3. 菌落形態(tài)對比
    4. 轉(zhuǎn)化子對炭疽病菌株C7-2拮抗作用
    5. 轉(zhuǎn)化子harpin蛋白的表達
    6. 轉(zhuǎn)化子粗蛋白能激發(fā)煙草產(chǎn)生過敏性反應并具有harpin蛋白的特性
    7. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株菌懸液對番茄種子的促生效果
    8. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株菌懸液對芒果炭疽離體葉片的拮抗作用
    9. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵液對番茄種子的促生作用
    10. HAB-5及其代表性轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵液對芒果炭疽離體葉片的拮抗效果
    11. TIBA對抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用
        11.1 TIBA對HAB-5菌懸液抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用
        11.2 TIBA對HAB-5發(fā)酵液抑制番茄種子生長的逆轉(zhuǎn)作用
四、討論
五、結論
六、創(chuàng)新點
七、參考文獻
已發(fā)表論文
課題來源
致謝



本文編號：3011561