乳蛋白因其具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要性而受到關(guān)注。因此,提高奶用動(dòng)物乳蛋白的產(chǎn)量,改善乳蛋白的組成一直是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家所關(guān)注的熱點(diǎn),闡明乳蛋白合成調(diào)控的機(jī)制是目前解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵所在。本研究中通過(guò)使用T1R1 siRNA干涉小鼠乳腺上皮細(xì)胞系（HC11）中的T1R1并結(jié)合氨基酸（AA）刺激,發(fā)現(xiàn)T1R1參與小鼠乳腺上皮細(xì)胞AA的感知;抑制T1R1后HC11細(xì)胞mTOR信號(hào)通路的活性被顯著抑制。必需氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞受氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn),研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制T1R1使氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A5、SLC3A2和SLC1A5的表達(dá)量顯著上調(diào);但細(xì)胞內(nèi)AA的濃度差異不顯著,結(jié)果也進(jìn)一步的證實(shí)了敲低T1R1會(huì)使氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)上調(diào)而不影響細(xì)胞內(nèi)AA的濃度的已有結(jié)論。通過(guò)使用氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑2-氨基雙環(huán)-（2,2,1）-庚烷-2-羧酸（BCH）和γ-L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺-水合物（GPNA）,證實(shí)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也參與mTOR信號(hào)通路的調(diào)控,T1R1 siRNA與BCH、GPNA聯(lián)合作用可以進(jìn)一步抑制mTOR信號(hào)通路的活性。以T1R1基因敲除小鼠為模型,發(fā)現(xiàn)敲除T1R1可以顯著下... 

【文章來(lái)源】：江蘇師范大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：86 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
2 文獻(xiàn)綜述
    2.1 乳腺泌乳研究進(jìn)展
        2.1.1 泌乳及其調(diào)節(jié)
        2.1.2 乳蛋白的組成及功能
        2.1.3 乳蛋白合成及調(diào)控
    2.2 mTOR信號(hào)通路研究進(jìn)展
        2.2.1 mTOR信號(hào)通路概述
        2.2.2 mTOR上游信號(hào)通路
        2.2.3 mTOR下游信號(hào)通路
    2.3 氨基酸與mTOR信號(hào)通路的調(diào)控
    2.4 G蛋白偶聯(lián)受體T1R1/T1R3及對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)控
        2.4.1 G蛋白偶聯(lián)受體
        2.4.2 T1R1/T1R3與氨基酸的感知及mTOR信號(hào)通路的調(diào)控
3 T1R1/T1R3對(duì)小鼠乳腺上皮細(xì)胞系HC11細(xì)胞氨基酸的感知和乳蛋白的合成調(diào)控機(jī)制研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品
        3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)所用試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 RNA干涉
        3.2.2 不同抑制處理
        3.2.3 細(xì)胞總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）
        3.2.5 Western blot
        3.2.6 氨基酸濃度分析
        3.2.7 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 T1R1與T1R3在HC11細(xì)胞中的表達(dá)情況分析
        3.3.2 干涉T1R1對(duì) β-casein的影響分析
        3.3.3 沉默T1R1對(duì)mTOR的影響
        3.3.4 抑制T1R1對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響
        3.3.5 沉默T1R1和抑制氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)mTOR信號(hào)通路的作用
        3.3.6 沉默T1R1對(duì)HC11細(xì)胞內(nèi)氨基酸濃度的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 T1R1/T1R3對(duì)小鼠乳腺組織不同時(shí)期乳蛋白合成的調(diào)控機(jī)制研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
        4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 小鼠基因分型
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠樣品采集
        4.2.3 冰凍切片及免疫熒光（Immunofluorescence）
        4.2.4 泌乳量測(cè)定
        4.2.5 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        4.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        4.2.7 Western blot
        4.2.8 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果分析
        4.3.1 鼠尾DNA質(zhì)量檢測(cè)
        4.3.2 小鼠基因分型
        4.3.3 小鼠乳腺組織中T1R1與T1R3的表達(dá)情況分析結(jié)果
        4.3.4 qPCR及Western blot分析T1R1在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況
        4.3.5 T1R1敲除小鼠與野生型小鼠泌乳量測(cè)定結(jié)果
        4.3.6 β-酪蛋白合成檢測(cè)
        4.3.7 敲除T1R1對(duì)mTOR信號(hào)通路的影響分析結(jié)果
        4.3.8 敲除T1R1對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響分析結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
5 T1R3對(duì)T1R1 KO及WT小鼠mTOR信號(hào)通路的調(diào)控分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 外植體的準(zhǔn)備
        5.2.2 外植體的培養(yǎng)及處理
        5.2.3 Western blot
        5.2.4 數(shù)據(jù)處理
    5.3 結(jié)果分析
        5.3.1 T1R3在小鼠乳腺中的表達(dá)分析
        5.3.2 抑制T1R3對(duì)T1R1 KO及WT小鼠mTOR信號(hào)通路的影響
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
6 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    6.3 展望
附錄
    附錄1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
        1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        1.2 試劑
        1.3 溶液的配制
    附錄2 細(xì)胞及組織總RNA的提取
        2.1 總RNA提取步驟
        2.2 總RNA質(zhì)量分析
        2.3 總RNA濃度測(cè)定
    附錄3 Western blot實(shí)驗(yàn)
        3.1 Western blot相關(guān)試劑配制
        3.2 BCA定量
        3.3 Western blot實(shí)驗(yàn)步驟
    附錄4 冰凍切片及免疫熒光
        4.1 冰凍切片
        4.2 免疫熒光（雙標(biāo)）
    附錄5 pMD 19-T基因克隆轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷
學(xué)位論文數(shù)據(jù)集


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛奶乳脂肪和乳蛋白的合成與調(diào)控機(jī)理[J]. 王加啟.  飼料與畜牧. 2011(02)

碩士論文
[1]魯西牛消化道各段T1R1、T1R3及pepT1基因的表達(dá)差異性研究[D]. 陳曉慧.江蘇師范大學(xué) 2013



本文編號(hào)：2956645