發(fā)布時間：2020-11-17 19:42

　　 細菌的群體感應系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)是依賴于種群密度的細菌之間的信息交流。群體感應系統(tǒng)能夠調節(jié)自由生活細菌的群體行為,也可調控與宿主之間的相互作用。大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110能與大豆形成根瘤,具有優(yōu)良的共生固氮特性。對該根瘤菌群體感應系統(tǒng)進行研究,有助于加深對大豆-根瘤菌共生固氮體系的認識,為根瘤菌的農業(yè)生產應用提供理論依據(jù),也對全球氮生態(tài)循環(huán)研究具有重要的意義。本論文以大豆慢生型根瘤菌模式菌株Bradyrhizobium diazoefficiens USDA110(B.d 110)為研究對象,探究了染色體上LuxI-LuxR型群體感應基因blr1062(bjaR1)-blr1063(bjaI)在根瘤菌共生中的生物學作用。研究結果如下:1.blr1062調節(jié)基因與blr1063結構基因作為一個操縱子發(fā)揮功能,相互之間進行環(huán)式調控;blr1063基因的表達受到大豆金雀異黃酮(Genistein)誘導,但是被大豆種子浸提液(SSE)顯著抑制。與野生株相比,blr1062突變株在半固體豐富培養(yǎng)基(YMB)上運動性顯著增強48.3%,表明blr1062突變有利于根瘤菌快速在大豆植株根部定殖,以形成根瘤。2.與大豆的接種實驗結果顯示:與野生株相比,blr1062突變株接種的大豆在側根上的根瘤數(shù)增加,總根瘤數(shù)與根瘤干重略有提高,固氮酶活性及根系表面積分別顯著增加82.6%和9.9%,表明blr1062的突變有利于結瘤固氮。這也進一步表明,Blr1062可能是作為負調控因子參與這些共生固氮過程。3.在綜合文獻的基礎上,構建了B.d 110中參與結瘤調控關鍵基因的lacZ報告基因轉錄融合體。相較于野生株,blr1062突變株中參與負調控結瘤數(shù)的nwsA、nolA與nodD2調控基因,特別是后兩者的表達顯著降低,而參與結瘤因子合成的結構基因nodY的表達顯著增強;與此相反,正調控結瘤數(shù)的nodD1、nodW等基因的表達差異不明顯。此外,blr1062的突變降低了三型分泌系統(tǒng)中相關基因(ttsI與rhcN)的表達,但是差異不明顯。這些結果表明,群體感應系統(tǒng)可能通過NolA以及NodD2參與負調控根瘤菌結瘤過程,這也與接種實驗結果相一致。4.轉錄組分析結果顯示,上述參與結瘤調控關鍵基因的表達與通過lacZ報告基因獲得的結果基本相一致。此外,blr1062的缺失突變使得KEGG富集中大量參與氮代謝通路上相關基因的表達顯著下調。在添加不同氮源的最小液體培養(yǎng)基中,blr1062突變體菌株與野生體菌株生長呈現(xiàn)明顯差異,表明群體感應系統(tǒng)可能參與根瘤菌的氮代謝過程,從而影響固氮酶活性,但是機理不清楚。蛋白質組學分析顯示,盡管差異蛋白的結果與轉錄組獲得的差異基因的結果并不相關,但是KEGG通路富集中,參與群體感應系統(tǒng)的大量基因在翻譯水平顯著上調。此外,氮代謝過程中,只有谷氨酰胺合成酶與谷氨酸脫氫酶的蛋白表達顯著下調,并得到酶活性分析的驗證支持。綜合以上結果,大豆慢生型根瘤菌中的群體感應系統(tǒng)可能通過NodD2參與根瘤菌負調控結瘤,并且參與氮代謝過程,從而影響根瘤菌的固氮作用。
【學位單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

蘭州大學碩士學位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應系統(tǒng)在共生過程中的功能研究2于植物根系，根毛彎曲，隨后根瘤菌侵入根毛。根瘤菌進入植物體后，經歷一個分化過程，開始表達固氮酶以及其它固氮所必需的基因，從而給植物提供氮源[5]。根瘤菌與大豆發(fā)生共生結瘤一般包含以下幾個過程：（1）根瘤菌感知到豆科植物根系分泌到根際的信號分子例如類黃酮化合物（圖1.1a），誘導細菌調節(jié)蛋白NodD激活參與菌株特異性信號分子合成的nod（結瘤）基因轉錄（也被稱為Nod因子/NFs）；（2）根瘤菌附著在根毛的頂端，分泌NFs，開啟根瘤發(fā)育過程，包括根毛變形和皮層內根瘤原基的形成（圖1.1b）；（3）根毛頂端的根瘤菌進入卷曲的根毛中形成感染線，之后在根毛內部伸長，穿過多個細胞層，到達正在發(fā)育的根瘤原基[6]（圖1.1c-f）；（4）根瘤菌通過一種類似內吞作用的機制侵入植物細胞質，細胞擴大，形成稱為共生體的細胞器樣結構（圖1.1g）開始固氮[7]；（5）根瘤菌DNA在入侵的植物細胞中復制，而被感染的植物細胞則成為擁有數(shù)千個共生體的大型多倍體細胞[8]；（6）有限根瘤無持續(xù)的分生組織，變成球狀（圖1.1h-j），成熟的共生體包含多個正常大小的類菌體；（7）根瘤開始從中心衰老，并延伸到周圍[9]，從解體的根瘤菌釋放進入下一個生命周期（圖1.1k）。圖1.1有限根瘤形成過程[10]Fig1.1Theprocessoflimitednoduleformation大豆植物與根瘤菌的共生固氮體系具有很高的經濟與生態(tài)效益，共生系統(tǒng)的建立涉及雙方信號物質的交流。對共生固氮過程中根瘤菌與大豆如何進行信號傳遞，以促進雙方的生長與發(fā)展的研究具有重大意義，同時也為進一步促進綠色農業(yè)和生態(tài)文明建設提供科學依據(jù)。1.2群體感應系統(tǒng)介紹1.2.1細菌的群體感應系統(tǒng)細菌在

蘭州大學碩士學位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應系統(tǒng)在共生過程中的功能研究6圖1.2群體感應系統(tǒng)中有關的信號通路[44]Fig1.2Relatedsignalpathwaysinquorumsensingsystem2011年在B.d110中發(fā)現(xiàn)了一處參與群體感應信號分子合成的基因位點：bjaI，它的多肽序列與兩種AHL合成酶（BtaI和RpaI）密切相關，并產生了一種獨特的高絲氨酸內酯（HSL），此信號分子不是BtaI和RpaI產生的芳基-HSL，而是支鏈脂肪�；�-HSL，即異戊�；呓z氨酸內酯（IV-HSL）。參與信號分子合成與調控基因位點是bjaR1和bjaI（圖1.3）。其中結構基因bjaI（blr1063）是LuxI家族同源物，編碼產生的IV-HSL合成酶不像其他脂肪�；�-HSL合酶選擇�；�-ACP作為活化的脂肪酸底物，而是利用�；�-CoA作為�；d體，催化合成IV-HSL。因此AHL合成酶亞家族，包括RpaI，BtaI和BjaI[45]。調節(jié)基因bjaR1（blr1062）是LuxR家族同源物，可與低密度的IV-HSL結合，激活下游基因表達。細菌通常需要納摩級信號濃度[46]來激活下游基因，但B.d110產生的IV-HSL大約是2-10nM，而IV-HSL濃度為10pm就可誘導bjaR1基因的表達，表明IV-HSL的產生量能夠建立一個群體感應信號通路[45]，雖然誘導bjaI表達的基礎水平低，但通過外源添加IV-HSL可使bjaI基因表達增強約20倍，并且B.d110不需要外源底物來產生IV-HSL。CarolineS.Harwood等人雖然分離純化了自誘導物IV-HSL，并首次闡明了該位點作為LuxR/LuxI型群體感應效應系統(tǒng)的一些獨特性，但是B.d110是共生固氮細菌，此群體感應的兩個基因位點bjaR1（blr1062）-bjaI（blr1063）是否以及如何參與共生沒有研究。因此本文對此位點的基因功能進行了探究。

蘭州大學碩士學位論文大豆慢生型根瘤菌Bradyrhizobiumdiazoefficiens群體感應系統(tǒng)在共生過程中的功能研究7圖1.3bjaR1-bjaI基因位點[45]Fig1.3ThegenelocusofbjaR1-bjaI1.3實驗內容和目的、意義1.3.1實驗內容和目的本研究主要內容包括：（1）群體感應系統(tǒng)表達模式分析，blr1062缺失突變對大豆植株的共生固氮影響；（2）利用lacZ報告基因，比較探究blr1062突變株與野生株中，調控結瘤基因表達信號通路上關鍵基因的表達模式；（3）利用轉錄組與蛋白組學手段，從全基因組水平，分析blr1062突變帶來的調控網絡變化。研究目的：圍繞參與群體感應的兩個基因（blr1062與blr1063），在構建缺失突變株基礎上，構建功能回復株及相關的lacZ融合菌株，探究此基因位點是否影響共生，闡明此位點缺失對于和結瘤基因有關的信號通路的影響，同時運用轉錄組與蛋白組學初步挖掘影響共生的機制。1.3.2研究意義多個國家在農業(yè)生產上面臨為提高產量長期使用化學施肥，造成土壤結塊、耕地質量下降、生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞等一系列問題。為了農業(yè)可持續(xù)發(fā)展以及大自然與人的和諧相處[47]，具有高效固氮能力的根瘤菌可應用于生產，不僅可以增強大豆結瘤固氮能力，而且能減少使用氮肥帶來的生態(tài)環(huán)境污染問題。為更好地提高農作物產量與質量，減少對生態(tài)環(huán)境造成的傷害，許多國家包括中國正致力于研發(fā)高質量菌株，促進綠色農業(yè)的發(fā)展。在根瘤菌中，B.d110由于能與大豆形成根瘤且具有優(yōu)良的共生固氮特性成為最重要的農業(yè)物種，被廣泛應用于分子遺傳學和生態(tài)學。影響根瘤菌和宿主植物相互作用的一個重要因素是群體感應系統(tǒng)，長期以來，對于群體感應基因的功
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5 ;大豆接種根瘤菌增產顯著[J];廣西農業(yè)科學;1965年06期

6 關興照,李成泰,張朝清,石桂芳;大豆施氮肥接種根瘤菌效果研究[J];黑龍江農業(yè)科學;2000年04期

7 劉發(fā),張永庫,張振江,劉英華,陳質清,侯殿孝,萬麗華;黑龍江省北部高寒地區(qū)大豆接種根瘤菌的效果與應用技術[J];大豆科學;1986年03期

8 Branden J.Furseth;Shawn P.Conley;Jean-Michel Ané;孫明明;;美國威斯康星州大豆對土著根瘤菌及根瘤菌促生劑的反應[J];大豆科學;2012年02期

9 卜常松,張學江,江木蘭,胡小加;單株根系來源的土著大豆慢生根瘤菌多樣性[J];生物多樣性;1996年04期

10 ;大豆接種根瘤菌增產效果試驗簡報[J];江西農業(yè)科技;1981年02期

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7 姚堯;中國南方廣東廣西慢生根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育及全基因組分析[D];中國農業(yè)大學;2015年

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本文編號：2887846