發(fā)布時間：2020-11-14 15:10

　　 少棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch為《中國藥典》收載蜈蚣藥材唯一基原。對野生資源的依賴導致其出現(xiàn)供不應(yīng)求的局面,人工養(yǎng)殖一直未有成熟技術(shù)報導。而在市場流通過程中,其體長是影響蜈蚣藥材價格的主要因素,多棘巨蜈蚣Scolopendra subspinipes subspinipes因與少棘巨蜈蚣外形相似但體長較長,在市場流通過程中多混為蜈蚣藥材高價銷售。少棘巨蜈蚣所在的唇足綱含有三千多個物種,普遍富含毒液,已成為藥物研發(fā)的重要資源,但唇足綱所屬的各蜈蚣目之間在形態(tài)分類學存在明顯的爭議,一定程度上限制了毒液資源的合理開發(fā)。另外,少棘巨蜈蚣資源嚴重減少和部分區(qū)域逐漸枯竭現(xiàn)狀的出現(xiàn),傳統(tǒng)依賴于野生捕捉已難以滿足市場需求,而隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的成熟,優(yōu)良蜈蚣品種的選育、推廣已成為推廣蜈蚣養(yǎng)殖的重要舉措。本研究針對蜈蚣藥材在鑒定、分類和養(yǎng)殖過程中存在的問題,分別采用以下方法:1)對蜈蚣野生習性進行細心觀察,總結(jié)藥農(nóng)多年的養(yǎng)殖經(jīng)驗,發(fā)現(xiàn)并歸納了一套標準化的蜈蚣養(yǎng)殖過程;并進一步補齊蜈蚣藥材商品規(guī)格等級標準的缺失,綜合文獻梳理、產(chǎn)地調(diào)研和市場調(diào)研結(jié)果,理清蜈蚣市場流通現(xiàn)狀和商品規(guī)格等級沿革,制定標準草案,征求專家意見反饋的方式制定了蜈蚣藥材商品規(guī)格等級標準。2)對少棘和多棘巨蜈蚣線粒體COI序列進行比對,根據(jù)變異位點情況采用LAMP Designer軟件設(shè)計了一套少棘巨蜈蚣LAMP引物,在恒溫條件下考察了引物的靈敏度和特異性。3)針對唇足綱存在的形態(tài)分類學爭議,采用Illumina二代測序技術(shù)對少棘巨蜈蚣線粒體基因組進行測序、組裝,結(jié)合唇足綱已經(jīng)公布的7種其他蜈蚣線粒體基因組進行比對、構(gòu)建基于13個蛋白編碼基因唇足綱ML系統(tǒng)發(fā)育樹。4)結(jié)合養(yǎng)殖過程中總結(jié)的經(jīng)驗和蜈蚣本草考證發(fā)現(xiàn)的蜈蚣存在“紅足”和“黃足”兩種性狀以及市場流通的蜈蚣藥材大部分來源于湖北和浙江的特點,收集了來自于湖北和浙江兩個主產(chǎn)區(qū)的紅足與黃足蜈蚣共9條,采用轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合蛋白質(zhì)組學技術(shù)對湖北黃足蜈蚣(HY)、湖北紅足蜈蚣(HR)和浙江紅足蜈蚣(ZR)進行比較分析,并通過生物信息學分析挖掘在蜈蚣生長過程中的抗性蛋白。采用上述方法,獲得的主要結(jié)果和討論如下:1.蜈蚣獨特的生長習性和對環(huán)境的嚴格要求是限制人工養(yǎng)殖的主要障礙,蜈蚣作為夜間活動動物,每年4-5月份交配,7-8月份產(chǎn)卵,9月份孵化成為幼蜈蚣。并且為滿足蜈蚣群居的特性,設(shè)計了雞蛋托狀專用養(yǎng)殖模具,將新鮮食物釘在固定的木板上有效避免蜈蚣疾病的產(chǎn)生和傳播。根據(jù)文獻梳理、市場調(diào)研和產(chǎn)地調(diào)研結(jié)果,蜈蚣藥材目前有蜈蚣條和蜈蚣皮兩種商品規(guī)格,蜈蚣條根據(jù)體長分為三個等級,蜈蚣皮作統(tǒng)貨銷售。2.針對于少棘巨蜈蚣和偽品多棘巨蜈蚣COI序列變異位點,設(shè)計出一套含有2條外引物、2條內(nèi)引物和2條環(huán)引物的特異性LAMP引物,該引物可在65℃恒溫條件下與少棘巨蜈蚣特異性結(jié)合,30 min內(nèi)少棘巨蜈蚣反應(yīng)體系由紫色變?yōu)樘焖{色,而偽品多棘巨蜈蚣顯紫色不變,同時,該反應(yīng)靈敏性較高,可以檢測到的少棘巨蜈蚣DNA達到皮克級別。3.采用Illumina二代測序技術(shù)對少棘巨蜈蚣線粒體基因組進行了成功組裝,線粒體基因組全長15 011bp,由13個蛋白編碼基因、14個tRNA和2個rRNA基因組成,且發(fā)現(xiàn)9個短片段重復序列(SSR)變異位點,ML系統(tǒng)發(fā)育樹顯示,蚰蜒目作為獨立的一支,而在另一支內(nèi)部,石蜈蚣目和地蜈蚣目顯示了更近的親緣關(guān)系,少棘巨蜈蚣所在的蜈蚣目則作為石蜈蚣目與地蜈蚣目的姊妹群存在。4.轉(zhuǎn)錄組比較分析發(fā)現(xiàn),湖北黃足蜈蚣(HY)與湖北紅足蜈蚣(HR)具有更為相似的基因表達情況,僅存在6個顯著性差異表達基因,而湖北紅足蜈蚣(HR)與浙江紅足蜈蚣(ZR)共有1579個差異表達基因。蛋白質(zhì)總量顯示湖北紅足蜈蚣(HY)與浙江紅足蜈蚣(ZR)均比湖北黃足蜈蚣(HY)具有更高的蛋白總量;與湖北蜈蚣相比,兩個病毒防御蛋白在浙江紅足蜈蚣(ZR)具有更高的表達水平。綜上所述,本研究針對于少棘巨蜈蚣在流通、應(yīng)用和人工養(yǎng)殖過程中所面臨的問題,總結(jié)了一套標準的、具有大規(guī)模推廣價值的養(yǎng)殖技術(shù),還制訂了蜈蚣藥材商品規(guī)格等級中華中醫(yī)藥學會團體標準用以引導蜈蚣藥材市場流通。將LAMP快速檢測技術(shù)應(yīng)用于蜈蚣藥材檢測,有望進一步應(yīng)用于市場快速檢測蜈蚣藥材真?zhèn)�。線粒體基因組的組裝和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建為唇足綱分類提出了更為豐富的數(shù)據(jù)支撐。轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組結(jié)果顯示了在少棘巨蜈蚣生長和進化過程中,區(qū)域環(huán)境因素相比于蜈蚣足部顏色具有更大的影響,紅足蜈蚣具有比黃足蜈蚣更高的蛋白含量,病毒防御蛋白的在不同蜈蚣之間的差異表達對于指導蜈蚣優(yōu)良品種選育具有重要的參考意義。
【學位單位】：湖北中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S899.9
【部分圖文】：

蜈蚣標準化養(yǎng)殖與多組學品質(zhì)評價研究日清晨將木板取出，對木板進行清洗消毒，丟棄食物殘渣。圖1-1蜈蚣養(yǎng)殖池日間記錄Figure1-1TheappearanceofapondwithS.mutilans。圖1-2雞蛋托狀養(yǎng)殖模具示意圖和形態(tài)圖Figure1-2.S.mutilanslieintheirspecialnest.在蜈蚣的活動季節(jié)，應(yīng)加強對蜈蚣的活動觀察，在夜間縮小手電筒光圈對蜈蚣進行觀察，觀察其健康狀況（體表顏色、行動、進食等），交配情況以及飼養(yǎng)池的安全。如發(fā)現(xiàn)蜈蚣個體異常，應(yīng)及時記錄并單獨飼養(yǎng)觀察，待確認正常后再放回飼養(yǎng)池。因為蜈蚣對環(huán)境具有較高的要求，蜈蚣飼養(yǎng)池的溫度應(yīng)保持在22-30℃之間，空氣相對濕度60%-70%，飼養(yǎng)土濕度維持在15%-20%；尤6

蜈蚣標準化養(yǎng)殖與多組學品質(zhì)評價研究日清晨將木板取出，對木板進行清洗消毒，丟棄食物殘渣。圖1-1蜈蚣養(yǎng)殖池日間記錄Figure1-1TheappearanceofapondwithS.mutilans。圖1-2雞蛋托狀養(yǎng)殖模具示意圖和形態(tài)圖Figure1-2.S.mutilanslieintheirspecialnest.在蜈蚣的活動季節(jié)，應(yīng)加強對蜈蚣的活動觀察，在夜間縮小手電筒光圈對蜈蚣進行觀察，觀察其健康狀況（體表顏色、行動、進食等），交配情況以及飼養(yǎng)池的安全。如發(fā)現(xiàn)蜈蚣個體異常，應(yīng)及時記錄并單獨飼養(yǎng)觀察，待確認正常后再放回飼養(yǎng)池。因為蜈蚣對環(huán)境具有較高的要求，蜈蚣飼養(yǎng)池的溫度應(yīng)保持在22-30℃之間，空氣相對濕度60%-70%，飼養(yǎng)土濕度維持在15%-20%；尤6

湖北中醫(yī)藥大學2020屆碩士學位論文其在天氣變化劇烈時節(jié)，應(yīng)通過增加供暖、通風、灑水等設(shè)施以維持飼養(yǎng)池的溫度和濕度。2.3.2蜈蚣的繁殖管理在蜈蚣種源引進時，可以選自野外捕捉或從正規(guī)種源廠引種，首選身體完好無損，體表光澤的三齡以上種蜈蚣，雌：雄配種比例為1-3:1。種蜈蚣在進入新環(huán)境的2到3天內(nèi)會有部分蜈蚣不進食，此時不可大量投喂餌料。要檢查蜈蚣池的防逃措施是否完善，待適應(yīng)新環(huán)境時，再逐步提高投喂餌料量。蜈蚣一般在3-5月份交配，在此期間需消耗大量的體能與營養(yǎng)物質(zhì)，并且交配成功后45天左右的時間內(nèi)不食不飲。因此，在其繁殖產(chǎn)卵之前，必須供給優(yōu)質(zhì)足量的餌料。繁殖期間可以通過縮小手電筒光圈觀察蜈蚣的生命活動和周圍安全情況，發(fā)現(xiàn)問題，及時解決。圖1-3蜈蚣繁殖過程的不同時期Figure1-3.ThereproductiveprocessofS.mutilans.蜈蚣通常每年6-7月份產(chǎn)卵，將卵抱入懷中，到8-9月孵化，期間應(yīng)保持安靜，禁止翻動養(yǎng)殖池，避免因驚動造成流產(chǎn)、吞卵等問題。孵卵期間因部分蜈蚣不再進食，可以適當減少食物投放量，但必須正常按時補水；并使養(yǎng)殖池保持在80%左右適宜的濕度，溫度控制在30℃-32℃上下，避7
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本文編號：2883618