促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)級聯(lián)反應(yīng)是植物生長發(fā)育、激素及脅迫的響應(yīng)信號通路中重要信號網(wǎng)絡(luò)之一。MAPKKs是其主要成員之一,在該級聯(lián)反應(yīng)中位于通路中間、對信號傳遞起著收集和發(fā)散的關(guān)鍵作用的激酶。本實驗室前期工作中,對馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)StMAPKKs家族基因進行了鑒定,共鑒定出5個StMAPKKs基因,不同脅迫處理下馬鈴薯StMAPKKs基因熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫下該基因家族中StMAPKK1基因表達量升高最為顯著。所以,本研究旨在對鮮有報道的StMAPKK1基因的調(diào)控功能及信號通路上的互作蛋白進行挖掘和解析,以期為深入研究馬鈴薯抗逆應(yīng)答反應(yīng)中的MAPK、MAPKK及MAPKKK信號傳導(dǎo)級聯(lián)系統(tǒng)的分子機理和代謝網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。為此,本研究用生物信息學(xué)方法對StMAPKK1基因進行了序列和功能分析;使用同源重組方法構(gòu)建了酵母(Saccharomyces cerevisiae)雙雜交系統(tǒng)誘餌載體pGBKT7-StMAPKK1、亞細(xì)胞定位表達載體pCEGFP-StMAPKK1以及雙分子熒光互補表達載體pSPYCE-StMAPKK1和pSPYNE-StMAPKK1;利用酵母雙雜交技術(shù)從馬鈴薯‘紫花白’酵母雙雜交cDNA文庫經(jīng)過大量篩選,獲得了與馬鈴薯StMAPKK1相互作用的蛋白質(zhì);對篩選出的馬鈴薯StMAPKK1互作蛋白基因進行了生物信息學(xué)基因序列分析及基因功能注釋。取得了以下主要研究結(jié)果:1.采用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),馬鈴薯StMAPKK1是等電點為5.47的穩(wěn)定蛋白質(zhì)和親水蛋白質(zhì),無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,含有絲氨酸和蘇氨酸為主的蛋白磷酸化位點,含有Protein kinase domain(PF00069)結(jié)構(gòu)域。StMAPKK1基因定位于細(xì)胞質(zhì)中,含有涉及植物激素ABA、GA_3和乙烯響應(yīng)相關(guān)、植物逆境脅迫干旱響應(yīng)、厭氧誘導(dǎo)和損傷應(yīng)答相關(guān)以及光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件。StMAPKK1基因在組織中表達存在特異性,在生物脅迫BABA和晚疫病病菌處理下,以及非生物脅迫ABA、BAP和水分脅迫處理下基因表達量顯著變化。STRING v11.0中共預(yù)測出5種StMAPKK1互作蛋白,包括2種StMAPKKK蛋白,1種StMAPK蛋白,1個真核翻譯起始因子3的B亞基蛋白以及1個未被鑒定的蛋白質(zhì)。2.克隆了馬鈴薯StMAPKK1基因,采用同源重組方法構(gòu)建了StMAPKK1基因酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7-StMAPKK1,并將該誘餌載體轉(zhuǎn)入酵母Y187中,進行檢測證明該誘餌載體對酵母菌株無毒性和無自激活活性,可用于進一步酵母雙雜交實驗。3.采用酵母雙雜交方法,使StMAPKK1誘餌蛋白與馬鈴薯cDNA文庫雜交,雜交液共涂布于50個四缺QDO培養(yǎng)基上培養(yǎng),挑選出直徑較大的、呈白色或淺粉色的單菌落406個,通過初步X-α-Gal染色初步鑒定篩選,其中210個菌落在48 h內(nèi)生長并顯藍(lán)色,視其為陽性克隆,陽性率為51.72%。對陽性克隆進行PCR電泳檢測和測序,合并重復(fù)、冗余測序結(jié)果,最終篩選出5種與StMAPKK1互作的蛋白質(zhì)陽性克隆,分別命名為C1-C5。5種陽性克隆均通過小規(guī)模雜交驗證互作真實性。4.對StMAPKK1互作蛋白陽性克隆進行測序和Blast比對分析,鑒定得到的5個StMAPKK1互作蛋白基因C1-C5分別為:水解酶(水解O-糖基化合物)、RING-H2亞家族RHE蛋白、氰酸酯酶、ARF GTPase活化因子以及一個含有C2結(jié)構(gòu)域的蛋白。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),StMAPKK1互作蛋白均為親水性蛋白,且均含有數(shù)量不等的蛋白磷酸化位點。除C2基因可能定位于葉綠體類囊體膜或細(xì)胞核之外,其它StMAPKK1互作蛋白基因均定位于在細(xì)胞質(zhì)中。StMAPKK1互作蛋白基因均含有植物生長發(fā)育相關(guān)、激素和脅迫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件,并在組織表達及生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)中具有特異性。5.構(gòu)建了亞細(xì)胞定位表達載體pCEGFP-StMAPKK1可以用于后續(xù)StMAPKK1基因的亞細(xì)胞定位研究;構(gòu)建了雙分子熒光互補表達載體pSPYCE-StMAPKK1和pSPYNE-StMAPKK1,將用于StMAPKK1與其5個互作蛋白雙分子熒光互補實驗,對上述5對蛋白互作關(guān)系進行進一步驗證。
【學(xué)位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：S532
【部分圖文】：

馬鈴薯StMAPKK1基因(PGSC0003DMT400000744)CDs長度為1073 bp。亞細(xì)胞定位表達載體pCEGFP以及雙分子熒光互補表達載體pSPYCE-35S和pSPYNE-35S僅插入CDs序列,并末端去除終止子序列,使得載體表達馬鈴薯StMAPKK1蛋白末端可以連接熒光蛋白。根據(jù)同源重組引物設(shè)計原則插入片段5’和3’末端分別帶有和線性化載體兩端對應(yīng)的同源序列(包括酶切位點序列)21 bp,故亞細(xì)胞定位表達載體pCEGFP以及雙分子熒光互補表達載體pSPYCE-35S和pSPYNE-35S StMAPKK1基因PCR產(chǎn)物大小均為1112 bp,與電泳結(jié)果相符(圖6.1)。6.3.2 亞細(xì)胞定位表達載體和雙分子熒光互補表達載體線性化

亞細(xì)胞定位表達載體以及雙分子熒光互補表達載體酶切線性化電泳檢測

重組質(zhì)粒大腸桿菌菌液PCR檢測結(jié)果符合的菌液進行測序,將目的基因片段已正確插入的載體分別命名為pCEGFP-StMAPKK1、pSPYCE-StMAPKK1和p SPYNE-StMAPKK1。提取質(zhì)粒,并保存于-20℃?zhèn)溆谩?.4 討論
【參考文獻】

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本文編號：2881864